Développement de bibliothèques de protéines artificielles permettant la création d’outils de reconnaissance moléculaire innovants

Le travail de these presente une approche innovante pour la construction d’une bibliotheque de proteines basees sur l’ossature proteique. L’objectif est de generer une source de biodiversite artificielle permettant la creation de nouvelles capacites d’interaction avec des cibles d’interets. Une banque, basee sur une ossature proteique bacterienne avait deja ete construite dans l’equipe, mais elle necessitait d’etre optimisee. L’etape initiale a ete d’explorer les raisons de l’instabilite des proteines de la banque de premiere generation, ceci par des approches d’etude de la structure in silico suivie d’une strategie de mutagenese dirigee. Des positions destabilisantes existant dans la premiere banque ont donc ete remplacees dans la banque de deuxieme generation. La deuxieme etape a eu pour objectif de diminuer le nombre de positions diversifiees et de simplifier le schema de diversification des variants de la banque. Puis un procede de filtration et de shuffling de ces variants a ete mis au point pour augmenter la proportion de sequences codantes correctes. Une nouvelle strategie de filtration basee sur la technique d’exposition sur phage a ete elaboree, en exploitant le fait que la proteine matrice de la banque, l'ossature proteique a un partenaire biologique capable d’interagir sur la zone « constante », non modifiee par le schema de diversification. Ainsi les variants de la banque exposes dans une conformation correcte a la surface des phages ont pu etre captures par ce partenaire. Ensuite, les sequences correspondant a ces variants ont ete recombinees entre elles pour recreer une plus grande diversite utile. Une bibliotheque optimisee composee de 2.8 x 108 proteines independantes a ainsi ete obtenue. Cette nouvelle banque optimisee a permis de selectionner par Phage display, des interacteurs contre plusieurs cibles de structures differentes. Ces nouveaux interrupteurs sont specifiques de leurs cibles et presentent des affinites de l’ordre du μM. Une approche de sequencage a haut debit a egalement ete entreprise pour realiser une analyse plus approfondie des sequences de cette bibliotheque et de notre processus de selection. Cette approche nous a apporte une nouvelle dimension pour la caracterisation des banques construites au laboratoire notamment concernant la diversite reelle de ces banques. Pour le suivi de selections, nous avons apprehende le sequencage haut debit comme un moyen d’identifier les interacteurs specifiques d’une cible par l’analyse exhaustive des sequences issues des selections. L’objectif est ici de mettre au point un protocole utilisant l’approche NGS pour identifier les interacteurs specifiques isolees par Phage Display.