基于CRISPR/Cas9技术的 Wip 1基因敲除ST细胞的建立

旨在采用CRISPR/Cas9编辑系统获得Wip1基因敲除的猪睾丸（swine testis，ST）细胞，为后续在细胞水平上探究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响奠定基础。本研究将实验室已有的靶向Wip1基因第一外显子的两条sgRNA（sgWip1-1和sgWip1-2）分别连接到pX330-GFP和pX330-RFP载体，然后共转染ST细胞（从80~90日龄的猪胚胎睾丸组织中分离出未成熟的支持细胞）。利用流式细胞仪收集红绿双荧光阳性的ST细胞，以用于单克隆细胞挑选。对得到的30个单克隆细胞进行基因型鉴定，并将PCR产物进行T-A克隆。结果显示，有29个单克隆细胞出现了基因片段敲除，Wip1基因的片段敲除效率为96.7%。其中单等位基因片段敲除的有5个，纯合双等位基因片段敲除的有8个，杂合双等位基因片段敲除的有16个。本研究高效地构建了Wip1基因敲除的ST细胞，不仅为后续研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响提供了细胞模型，也为研究Wip1基因对公猪繁殖性能的影响奠定了基础。