Synthesis and applications of biomimetic silica-based nanoparticles

La formacion controlada de estructuras inorganicas -biomineralizacion- es un fenomeno biologico muy extendido en la Naturaleza, llevado a cabo por una gran diversidad de organismos, desde procariotas -por ejemplo, la sintesis de nanocristales de magnetita por bacterias magnetotacticas-, hasta el ser humano -formacion de los huesos y dientes-. Entre los ejemplos mas espectaculares de biomineralizacion se encuentra la intricada estructura de las paredes celulares de las diatomeas, algas eucariotas unicelulares presentes en habitats marinos. Dichas paredes estan compuestas de silice hidratada amorfa, y muestran estructuras porosas jerarquizadas con dimensiones que van desde los nanometros hasta las micras. Las nanoparticulas de silice son producidas mediante la policondensacion del Si(OH)4 (acido silicico) a un pH cercano a cinco en un compartimento intracelular especifico denominado vesicula de deposicion de silice. Este proceso esta controlado por proteinas y polisacaridos que actuan como plantillas para la condensacion de la fase inorganica en soluciones acuosas a temperatura ambiente. En base a este modelo, se han sintetizado nanoparticulas de silice mediante un procedimiento biomimetico. Para ello, se empleo tetrametil ortosilicato (TMOS) como fuente de silice y el polimero cationico polietilenimina (PEI) como plantilla. La reaccion de biosilificacion se produce en cuestion de segundos tras la adicion de TMOS hidrolizado a una disolucion tampon de polietilenimina a pH neutro. El dendrimero de segunda generacion PAMAM y la polilisina tambien fueron evaluados como moleculas plantilla para la formacion de estas nanoesferas. Entre las moleculas plantilla ensayadas, la polietilenimina de 25 kDa desempena un papel critico en el proceso de nucleacion de la fase inorganica y, por ende, en las propiedades finales de las nanoparticulas obtenidas. Las imagenes de microscopia electronica de barrido y las medidas de dispersion de luz pusieron de manifiesto una relacion exponencial entre la concentracion de polietilenimina de peso molecular 25 kDa y el tamano de particula, variando desde 1 µm hasta 400 nm. Se estudio asimismo la influencia del peso molecular y concentracion de polietilenimina, fuerza ionica del tampon, temperatura y pH sobre el tamano de particula. La produccion de silice se cuantifico mediante el metodo del molibdato azul, obteniendose una conversion de TMOS a SiO2 cercana al 80%. Las medidas de fluorescencia y de potencial ? mostraron que las nanoparticulas poseen una carga superficial positiva en un amplio rango de pH debido a la adsorcion de una capa de polietilenimina sobre su superficie. Estas muestran una distribucion de poros mesoporosa y un area superficial de 320 m2 g-1 determinada mediante isotermas de adsorcion/desorcion de nitrogeno. Se ha demostrado que las nanoparticulas de silice sintetizadas biomimeticamente son capaces de encapsular de forma eficiente una amplia variedad de biomoleculas, tales como enzimas y celulas. La peroxidada de rabano silvestre, su forma anionica, la D?fructosa dehidrogenasa, la tirosinasa y la glucosa oxidasa fueron inmovilizadas, mostrando una mayor estabilidad temporal frente a la correspondiente en tampon. Se determino del mismo modo el efecto del ratio de concentraciones tetrametil ortosilicato: polietilenimina y de la eleccion del agente lavador -agua o NaCl- sobre la eficacia en la inmovilizacion de enzimas. Siguiendo el protocolo de sintesis descrito, celulas de Gluconobacter oxydans fueron recubiertas con silice permitiendo la oxidacion de glicerol a dihidroxiacetona por accion de la enzima de membrana glicerol dehidrogenasa-pirroloquinonina quinona. El ensayo MTT fue empleado para determinar su actividad enzimatica en funcion de la temperatura y pH. La matriz de silice proporciona una mayor termoestabilidad a las celulas bacterianas al tiempo que estas preservan su actividad. Por ultimo, con objeto de integrar las nanoparticulas siliceo-enzimaticas en superficies transductoras para la construccion de biosensores, se plantearon dos posibles alternativas. En primer lugar, la deposicion de nanoparticulas de silice modificadas con la forma anionica de la peroxidada de rabano silvestre sobre electrodos de grafito dirimio en bioelectrocatalisis directa a 0 mV vs. Ag|AgClsat. En segundo lugar, se desarrollo una novedosa estrategia de inmovilizacion basada en la generacion in situ de biosilicatos sobre electrodos de oro previamente modificados con una monocapa autoensamblada de polietilenimina. Las medidas de microbalanza de cristal de cuarzo y las imagenes de microscopia electronica de barrido corroboraron la encapsulacion de la forma anionica de la peroxidasa sobre la superficie de oro. Esta metodologia permitio la bioelectrocatalisis directa de la enzima con la superficie electrodica a 0 mV vs. Ag|AgClsat.