Analysen zur Funktion von CC2D1A und CC2D1B im endosomalen Transportweg und zur Interaktion mit ESCRT-III Proteinen in Säugern

Die Proteine der CC2D1/Lgd Familie sind in allen Metazoen konserviert und besitzen vier DM14 Domanen und eine C2 Domane. In Drosophila wird Lgd fur die vollstandige Funktion der ESCRT-III Untereinheit Shrub benotigt und sein Verlust zu einer Storung im endosomalen Transportweg fuhrt. Fur die beiden Saugerorthologe CC2D1A und CC2D1B wurde eine solche Funktion bisher nicht beschrieben, dafur unter anderem Funktionen in mehreren Signalwegen. Beschrieben wurde bisher nur die in vitro Interaktion von CC2D1A mit allen CHMP4 Isoformen und von CC2D1B mit CHMP4B. In vitro reicht ein Fragment bestehend aus einer DM14 Domane von CC2D1A fur die Interaktion mit einem Fragment von CHMP4B. In Drosophila werden in vivo hingegen mindesten zwei DM14 Domanen fur eine Rettung des lgd Phanotyps benotigt. In dieser Arbeit konnte erstmals eine Funktion von CC2D1A und CC2D1B im endosomalen Transportweg nachgewiesen werden. Elektronenmikroskopische Analysen zeigen vergroserte endolysosomale Kompartimente in Cc2d1a-/- MEF Zellen. In Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF Zellen sind „Class E“ ahnliche endolysosomale Kompartimente zu beobachten, welche durch zusatzlichen Verlust eines Cc2d1 Gens kleiner sind. Beim zusatzlichen Ausfall beider Cc2d1 Gene in Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF Zellen sind deutlich mehr endolysosomale Kompartimente zu beobachten, welche allerdings nicht mehr den „Class E“ Phanotyp zeigen. Zudem lokalisiert endogenes CC2D1A an vergroserten Endolysosomen in Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF Zellen. Daruber hinaus werden die CC2D1 Proteine durch die ESCRT-III Assemblierung an endosomale Membranen rekrutiert und durch die Auflosung des Komplexes durch VPS4 wieder von dort entfernt. Aufgrund der Ergebnisse kann eine Funktion der CC2D1/Lgd Proteine an der endosomalen Membran „upstream“ von VPS4 vermutet werden. Mittels des PLA Systems konnte erstmals die endogene Interaktion von CC2D1A und CHMP4B in Zellen nachgewiesen werden. Mit Hilfe von FRET-APB Experimenten konnte zusatzlich erstmals gezeigt werden, dass CC2D1A und CC2D1B in lebenden Zellen mit den ESCRT-III Untereinheiten CHMP4A, CHMP4B und CHMP4C interagieren. Des Weiteren wurden mit den Hilfs-ESCRT Proteinen CHMP5 und CHMP7 bisher nicht beschriebene Interaktionspartner identifiziert. Daruber hinaus interagieren die CC2D1 Proteine jeweils mit sich und miteinander. Die Bedeutung der DM14 Domanen von CC2D1B fur die Interaktion mit CHMP4B, CHMP4C und CHMP7 wurde ebenfalls genauer charakterisiert. So interagiert CC2D1B uber unterschiedliche DM14 Domanen mit Diesen. Zudem konnten fur die Interaktion mit CHMP4B und CHMP7 Unterschiede bei den in der dritten DM14 Domane benotigten, konservierten Aminosauren gezeigt werden. Mit dem N-Terminus vor der ersten DM14 Domane beider CC2D1 Proteine und dem verlangerten C-Terminus von CC2D1A wurden zwei neue Domanen identifiziert, welche einen Einfluss auf Lokalisation, Regulation und Interaktion der Proteine haben.