nanoLC-MS/MS检测未成熟树突状细胞与其外泌体蛋白组分差异的初步研究

目的 采用一种相对快速、样品需求量少的纳升级液相色谱串联质谱（nanoLC-MS/MS）法初步探究未成熟树突状细胞DC2.4及其来源的外泌体（DC-Exo）蛋白组分差异。 方法 收集DC2.4细胞培养基上清，采用梯度离心法分离DC-Exo，使用蔗糖密度梯度超速离心进一步纯化而获得DC-Exo测定样品。采用Bradford法测定其蛋白总量，使用动态光散射法和透射电镜分别对DC-Exo粒度分布和形态进行考察。采用FASP酶解法制备DC2.4细胞和DC-Exo待测蛋白样品。nanoLC-MS/MS检测待测样品：采用μLPickUp上样模式，上样量仅1 μg，Transport liquid及Micro A相均为0.05%三氟乙酸-2%乙腈（V/V）aq.；nanoLC使用Acclaim® PepMap RSLC分析柱，流动相为（A）0.1%甲酸水溶液（V/V）和（B）0.08%甲酸-80%乙腈（V/V），采用梯度洗脱，流速为0.3 μL/min；MS/MS采用LTQ Obitrap双重质谱，使用APCI nanospray离子源，“一拖十”数据采集模式。得到结果以Uniport Mouse (Fasta文件) 为蛋白数据库，采用SQUEST对DC2.4细胞及DC-Exo蛋白质谱信息进行搜索和匹配，并整理分析。 结果 得到产量较高、粒径为40～200 nm的DC-Exo。用FASP酶解法处理得到的DC2.4细胞和DC-Exo冻干蛋白样品复溶后可直接上样，且上样量仅需1 μg。搜库结果显示，DC2.4细胞含蛋白998种，其中高表达227种，特有蛋白535种；DC-Exo仅含蛋白348种，其中特有高表达18种；两者共有蛋白为306种，共有高表达蛋白7种。 结论 本实验采用的nanoLC-MS/MS法所需进样量少，可相对快速地初步检测DC2.4细胞及其外泌体的蛋白组分差异。