Effet de la valence des ligands et des récepteurs sur la dynamique et l'organisation à l'échelle nanométrique de protéines membranaires synaptiques.

Les synapses sont des structures fortement compartimentees remplies de complexes de proteines interagissant entre elles. La fente synaptique reliant les compartiments pre- et post-synaptiques est une zone adhesive de 20 nm d'epaisseur, contenant des proteines d'adhesion et des recepteurs neurotransmetteurs. Les progres dans l'imagerie a haute resolution offrent une vision amelioree de l'organisation dynamique des proteines synaptiques. Cependant, une evaluation quantitative de la concentration et du niveau d'oligomerisation de ces complexes reste difficile. Ceci est en partie du au fait que les methodes traditionnelles d'identification des recepteurs s'appuient sur des anticorps, dont la taille relativement grande (~ 15 nm) peut conduire a un empechement sterique et un biais de localisation, alors que leur divalence provoque une reticulation des proteines. Ici, nous avons etudie l'impact de la valence de la sonde et des recepteurs sur la diffusion et l'organisation de 3 proteines synaptiques : Neurexin1β, neuroligine1 et la sous-unite du recepteur kainate GluK2. Nous avons utilise une technique de single molecule pull down pour caracteriser la composition de la sous-unite de ces proteines en observant des proteines possedant un tag GFP immobilisees sur un subtrat en utilisant une illumination TIRF. La neurexin1β presente essentiellement un step de photoblanchiment, tandis que la neuroligine1 presente principalement 2 steps, et GluK2 montre plusieurs steps, confirmant que ces proteines se rassemblent respectivement en monomeres, dimeres et tetrameres. Ensuite, nous avons utilise le FRAP pour surveiller la diffusion membranaire des 3 proteines marquees avec des sondes de valence differente. Nous avons etiquete des proteines recombinantes portant un marqueur N-terminal biotinyle avec une streptavidine monovalente, divalente ou tetravalente (ou avec un anticorps anti-biotine), tous conjugues aux memes fluorophore organiques. Nous avons egalement utilise une technique de STORM pour caracteriser le niveau d'agregation des 3 proteines en reponse aux differentes sondes. Nous montrons des effets drastiques en fonction de la nature de la proteine utilisee et de la valence de la sonde, suggerant que la diffusion est ralentie par l'agregation des recepteurs, mettant ainsi en evidence les enjeux cruciaux dans les strategies d'etiquetage, en particulier dans des espaces confines tels que les synapses