Estudio estructural de la β-fructofuranosidasa de Xanthophyllomyces dendrorhous y su empleo para la producción de oligosacáridos prebióticos y otros derivados fructosilados

espanolLa β-fructofuranosidasa XdINV de la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous es una proteina extracelular altamente glicosilada que cataliza la liberacion de fructosas de sustratos como sacarosa y rafinosa, ademas de sintetizar neo-fructooligosacaridos, compuestos en los que enlaces β(2-6) conectan unidades de fructosa a la glucosa de una sacarosa, interesantes en la industria alimentaria por sus caracteristicas prebioticas. En este trabajo se desarrollo un efectivo sistema de expresion heterologa basado en Pichia pastoris, que fue escalado a nivel de fermentador y permitio obtener grandes cantidades de proteina con caracteristicas bioquimicas y sinteticas muy similares a las del productor natural. A su vez, el sistema desarrollado constituyo una gran herramienta para la facil manipulacion de la secuencia genica responsable de XdINV, que se uso con el objetivo de ahondar en el analisis estructural de la proteina mediante mutagenesis dirigida. El estudio por RMN de los cristales proteicos obtenidos confirmo la estructura dimerica de XdINV, cuyos monomeros presentaban la arquitectura tipica de la familia 32 de las glicosilhidrolasas. Sin embargo, la proteina mostro un inusual patron de dimerizacion regido por la presencia de numerosos restos glucidicos unidos a residuos de asparaginas localizados en la interfase dimerica y una larga extension del extremo C-terminal de la proteina, no observada en otras proteinas de la familia. La obtencion de diferentes variantes mutagenicas de XdINV, asi como la de diversos complejos cristalograficos con diferentes sustratos, permitio senalar la importancia del residuo Trp105 y el bucle flexible TIV en la actividad y especificidad enzimatica de XdINV, asi como identificar hasta 4 subsitios de reconocimiento de sustratos. Ademas, las caracteristicas topologicas del centro activo de la proteina le permitieron albergar una gran cantidad de compuestos, siendo capaz de fructosilar diversos azucares, polialcoholes y hasta algunos derivados fenolicos, de los cuales se purificaron e identificaron el trisacarido neoerlosa, obtenido por la modificacion de maltosa, dos isomeros del hidroxitirosol fructosilado y la fructosil-hidroquinona. Por ultimo, se plantearon diferentes estrategias de inmovilizacion de XdINV con el objetivo de aprovechar el gran potencial de esta enzima a nivel industrial. De entre ellas, el biocatalizador generado por atrapamiento en hidrogeles de polivinil alcohol mostro las mejores caracteristicas en cuanto estabilidad operacional y formacion de FOS EnglishThe β-fructofuranosidase XdINV from the Xanthophyllomyces dendrorhous yeast is a highly glycosylated extracellular protein that catalyzes the release of fructose from substrates such as sucrose and raffinose. In addition, XdINV synthesizes neo-fructooligosaccharides, compounds with β(2-6) linkage connecting fructose units to the glucosyl moiety of sucrose, which are interesting in the food industry for its prebiotic characteristics. In this work, an effective heterologous expression system based on Pichia pastoris was developed to obtain large amounts of the studied protein using fed-batch fermentation. The heterologous protein holds similar characteristics to the one synthetized by the natural producer. Besides, the developed system established an essential tool for an easier manipulation of the XdINV gene in order to deepen the protein structural analysis through directed mutagenesis. The NMR study of the protein crystals confirmed the dimeric structure of XdINV, whose monomers presented the typical architecture of the glycosylhydrolases family 32. However, the protein showed an unusual pattern of dimerization governed by the presence of glycans linked to asparagine residues at the dimer interface and a long extension of the protein C-terminus, not observed in other proteins of the family. The different mutagenic variants of XdINV and the crystallographic complexes with diverse substrates highlighted the importance of the Trp105 residue and the TIV flexible loop in the activity and specificity of this enzyme, and identified up to 4 subsites of substrate recognition. In addition, the topological characteristics of the XdINV active site allowed to accommodate a large number of compounds, being able to fructosylate multiple sugars, polyalcohols and even phenolic compounds, from which the trisaccharide neoerlose (obtained by maltose modification), two isomers of the fructosylated hydroxytyrosol and fructosyl-hydroquinone were identified. Finally, different immobilization strategies of XdINV were proposed to exploit the vast industrial potential of this enzyme. Among them, the biocatalyst generated by entrapment in polyvinyl alcohol hydrogels showed the best characteristics in terms of operational stability and FOS formation.