Étude structurale du récepteur de l'urotensine-II et caractérisation du site de liaison

Les recepteurs a 7 passages transmembranaires couples aux proteines G (RCPGs) constituent, par leur complexite et leur diversite, une cible interessante pour le developpement d'outils pharmacologiques. Le recepteur UT (UT) fait partie de cette grande famille et est implique dans la regulation de l'activite biologique du plus puissant peptide vasoconstricteur identifie a ce jour chez l'homme, l'urotensine-11 (U-11). Le recepteur UT ainsi que U-11 sont, entre autres, presents au niveau du systeme cardiovasculaire humain. Tous deux representent de nouvelles cibles interessantes pour le developpement d'outils pharmacologiques utiles pour etudier la physiologie et certaines pathologies du systeme vasculaire. Cependant, les mecanismes moleculaires responsables de l'activation complete ou partielle de UT sont encore loin d'etre clairement elucides. Etant donne l'interet therapeutique que peut presenter le developpement d'agonistes et d'antagonistes selectifs pour ce recepteur, la comprehension de ces mecanismes constitue un enjeu majeur. Une meilleure comprehension des mecanismes d'activation de UT implique l'identification de son domaine de liaison et 1'elucidation de sa structure tridimensionnelle. Cependant, la caracterisation structurale des recepteurs transmembranaires heptahelicaux, dont UT, demeure une tâche fastidieuse a cause de leur faible solubilite en general et de forte taille, sans oublier le risque que represente la denaturation lors des etapes de purification. Ceci rend donc leur analyse structurale par des voies classiques, telles que la RMN et la cristallographie, tres complexe voire impossible. Depuis les annees 2000, une voie alternative a ete utilisee pour caracteriser par RMN la structure de grosses proteines. Cette nouvelle approche est basee sur l'analyse des segments individuels ou des domaines structuraux de la proteine, c'est-a-dire les boucles intra- et extracellulaires et/ou les segments transmembranaires dans le cas d'une proteine membranaire tel un RCPG. Cette technique a d'ailleurs ete utilisee pour elucider avec succes la structure de la rhodopsine bovine et de la bacteriorhodopsine. Plus precisement, la caracterisation structurale de tous leurs domaines structuraux par RMN et leur juxtaposition subsequente a permis d'elucider la structure complete des ces proteines membranaires dans leur forme native alors qu'auparavant seule leur structure cristallographique avait ete decrite. Ces etudes suggerent que la structure secondaire des domaines transmembranaires ainsi que des boucles cellulaires des RCPGs est stabilisee par des interactions a courtes distances gouvernees par la structure primaire rendant possible leur caracterisation structurale totale par le biais de l'analyse de sous fragments. De plus, une analyse similaire de la myohemerythrine, une proteine membranaire n'appartenant pas au RCPG, suggere que cette methodologie ne se limiterait pas uniquement a l'etude structurale des RCPGs, mais pourrait etre appliquee a l'etude de l'ensemble des proteines membranaires. Cette strategie offre ainsi une approche tres interessante pour l'etude structurale de UT. Mon projet de doctorat avait pour but de caracteriser le complexe U-IIIUT d'abord en identifiant le role de certains domaines structuraux de UT dans le processus de reconnaissance et d'activation en relation avec U-11, et ensuite en apportant des donnees sur la structure tridimensionnelle de ces domaines. Cette etude apporte donc de nouvelles donnees qui contribuent a une meilleure connaissance generale du complexe U-11/UT ce qui pourrait representer un atout supplementaire pour le developpement et/ou le raffinement d'outils pharmacologiques destines a l'etude du systeme cardiovasculaire. Elle contribue egalement a une meilleure comprehension structurale des RCPGs qui, malgre leur importance biologique, demeurent a ce jour peu caracterises. Les objectifs du projet de recherche ont ete de 1) cibler et developper par synthese peptidique des segments de UT representant des domaines structuraux susceptibles d'interagir avec U-11, 2) determiner leur capacite a interagir avec des ligands connus de UT a l'aide de la resonance plasmonique de surface (RPS), et 3) caracteriser par CD, RMN et par modelisation moleculaire l'arrangement tridimensionnel des domaines jouant un role clef dans le complexe U-II!UT. Ainsi, la realisation de ce projet a repose sur l'utilisation combinee d'approches experimentales originales basees sur des methodes chimiques et spectroscopiques couplees a des techniques de modelisation moleculaire reposant sur des donnees theoriques. A cet egard, cinq domaines structuraux ont ete construits par synthese peptidique en phase solide : trois boucles extracellulaires (EC-1, EC-11 et EC-III) et deux segments transmembranaires (TM-III et TM-IV). Par la suite, l'affinite de ces domaines pour differents ligands de UT, soit deux agonistes (U-11 et URP) et un antagoniste (Urantide), a ete determinee par RPS. Cette etude a permis d'etablir experimentalement la participation de la boucle extracellulaire-11 du recepteur UT dans la liaison selective des agonistes U-11 et URP, et de l'antagoniste Urantide. Les resultats de cette etude ont egalement demontre que contrairement a la boucle extracellulaire-11, la boucle extracellulaire-III ne peut lier selectivement que les agonistes U-11 et URP. Ces resultats suggerent donc que U-11 et Urantide lient EC-11 selon un mecanisme commun alors que la liaison avec EC-III jouerait davantage un role cle dans le processus d'activation du recepteur UT. Ainsi, il est possible de concevoir que de puissants antagonistes pourraient etre developpes en produisant des ligands de haute affinite ciblant la boucle EC-111. L'arrangement structural des domaines extracellulaires­ II et -III a par la suite ete caracterise a l'aide du dichroisme circulaire, de la RMN et de la modelisation moleculaire. De plus, l'arrangement moleculaire de ces domaines a pu etre determine dans un environnement micellaire. Nos resultats confirment la propension des fragments peptidiques de UT a adopter une conformation moleculaire organisee en solution. Plus precisement, les resultats ont montre que les domaines EC-II et EC-III adoptent une geometrie spatiale bien definie au niveau de l'interface des domaines transmembranaires et des boucles extracellulaires pouvant mettre en evidence des elements structuraux et chimiques essentiels pour la liaison de U-II. Enfin, une etude complementaire explorant par RMN le complexe EC-IIIIU-II et EC-IIIU-II a ete realisee afin d'identifier des interactions se manifestant entre des domaines synthetiques de UT et U-II. Le titrage par RMN du complexe EC-IIIU-II et EC-IIIIU-II a permis de suggerer certains determinants ou residus-cles composant le site de liaison de U-II. Nos travaux visant a identifier et a caracteriser le site de liaison de U-II ont donc conduit a une meilleure comprehension des bases moleculaires de l'activation de UT par U-11, mais egalement par l'URP et par l'Urantide. Enfin, notre etude permettra de mieux definir certaines proprietes de UT et pourraient mener a la conception de nouveaux outils moleculaires interessants.