Funkční analýza teplotně senzitivních mutantů nádorového supresoru p53

Protein p53 je nadorový supresor, který v odpovědi na buněcný stres vyvolava zastavu buněcneho cyklu nebo programovanou buněcnou smrt. To vede k eliminaci premalignich a malignich buněk a k prevenci vzniku nadorů. Ztrata funkce proteinu p53 hraje významnou roli v procesu karcinogeneze u větsiny typů nadorů. Vice než 50% nadorů obsahuje nefunkcni protein p53 v důsledku bodove mutace v genu p53. Reaktivace nadoroveho supresoru p53 se v posledni době jevi jako jedna z možných strategii specificky cilene, protinadorove terapie. Pomoci funkcni metody FASAY („functional analysis of separated alleles in yeast“), ktera se v nasi laboratoři využiva k rutinni analýze statutu proteinu p53 u různých typů nadorů, byl sestaven soubor 23 teplotně zavislých mutantů p53. Za využiti kvasinkoveho expresniho systemu jsme podrobně analyzovali funkcni a strukturni vlastnosti mutantů v nasem souboru. Studovali jsme transaktivacni schopnosti jednotlivých mutantů ve vztahu k teplotě kultivace a k sekvenci různých responzivnich elementů. Jednotlivi mutanti se mezi sebou lisili mirou teplotni zavislosti, tj. teplota, při ktere doslo k uplne nebo castecne obnově jejich transaktivacnich funkce, byla různa. Větsina teplotně zavislých mutantů vykazovala tzv. diskriminativni charakter, tj. lisila se mirou sve aktivity vůci různým responzivnim elementům. Při studiu strukturnich vlastnosti teplotně zavislých mutantů s využitim konformacně specifických protilatek jsme nenasli žadnou souvislost mezi mirou transaktivace a konformacnimi vlastnostmi jednotlivých mutantů p53. U 13 mutantů p53 jsme pozorovali castecnou reaktivaci jejich transaktivacnich schopnosti po působeni chemicke latky amifostinu. Pomoci pocitacoveho molekuloveho modelovani jsme zjistili, že větsina mutantů p53 (10/13), kteři jsou reaktivovani po působeni amifostinu, obsahuje mutaci v oblasti genu p53, ktera koduje hydrofobni β sendvicovou strukturu DNA vazebne domeny proteinu. Předpokladame, že amifostin tuto strukturu stabilizuje, cimž je castecně nebo zcela obnovena funkce cele domeny. Funkcnimi a strukturnimi analýzami jsme prokazali, že teplotně zavisli mutanti proteinu p53 tvoři znacně heterogenni skupinu proteinů. Mezi jednotlivými mutanty existuje znacna variabilita v konformacnich a funkcnich vlastnostech a ve schopnostech být za urcitých podminek reaktivovani. Výsledky nasi prace potvrzuji, že protein p53 je konformacně flexibilni a jeho funkci lze reaktivovat pomoci malých molekul jako je amifostin. Podrobna znalost funkcnich a strukturnich vlastnosti jednotlivých mutantů p53 a jejich stratifikace může být užitecna pro lepsi pochopeni ucinků specifických mutantů na procesy vedouci k transformaci nadorove buňky, při predikci průběhu nadoroveho onemocněni, jeho lecbě a take při vývoji latek schopných obnovy standardni funkce proteinu p53.