RNA ISOLATION AND DETECTION OF CELLULAR RNA QUANTITY OF SPERMATOZOA AND EMBRYOS PRIOR TO GENE EXPRESSION ANALYSES

DOI : 10.26650/IUITFD.416666 Amac : Ureme biyolojisi arastirmalarinda kullanilan ornekler genellikle, zor ulasilabilir, nadir ve tekrari olmayan hucre gruplaridir. Diger yandan, az sayida hucre ile calisildigindan dolayi, genetik analizlerde standart olarak kullanilan yontemlerde modifikasyonlara ihtiyac duyulmaktadir. Bu calismada amacimiz, gen ekspresyonu arastirmalarinda kullanilabilecek optimal duzeydeki total RNA’nin elde edilebilmesi amaci ile spermatozoa ve embriyo orneklerinden RNA izolasyon yonteminin gelistirilmesidir. Gerec ve Yontem : Yardimla ureme tedavisi kapsaminda kullanilmak amaci ile hazirlanan ve fertilizasyon islemi gerceklestirildikten sonra geriye kalan spermatozoa ornegi diger kontaminant hucrelerden saflastirilarak dondurulmustur. Diger yandan, embriyo transferinden sonra geriye kalan preimplantasyon donem embriyolar fosfat tamponlu tuz – polivinil alkol (PBS-PVA) karisimi icerisinde dondurularak saklanmistir. Spermatozoa ve embriyolardan optimal duzeyde total RNA elde edilmesi amaci ile cesitli optimizasyonlar yapilmistir. Elde edilen total RNA’lar kaliteleri ve miktarlari acisindan degerlendirilmistir. Spermatozoonda 28S ribozomal RNA (rRNA)’nin secimli olarak degrade olmasindan dolayi total RNA kalitesi, Bioanalyzer cihazi ile gerceklestirilen analize ek olarak gercek zamanli kantitatif PCR ile gen amplifikasyonu yapilarak da kontrol edilmistir. Bulgular : Izolasyonda yapilan uyarlamalardan sonra, takip eden gen ekspresyonu calismalarinda kullanilabilecek kalitede ve miktarda total RNA elde edilmistir. Ek olarak, orneklerden elde edilen hucresel total RNA miktarlarinin onceki calismalar ile uyumlu oldugu belirlenmistir. Sonuc : Daha sonra yapilmasi planlanan transkript profilleme arastirmalari icin on bir calisma olarak gerceklestirilen bu deneylerin sonucunda elde edilen bulgular, RNA izolasyon protokollerinde yapilan uyarlamalarin etkin oldugunu gostermektedir.