Canalización de precursores hacia la biosíntesis de isoprenoides plastídicos en Arabidopsis thaliana

Canalizacion de precursores hacia la biosintesis de isoprenoides plastidicos en Arabidopsis thaliana. Los isoprenoides constituyen la familia de metabolitos funcional y estructuralmente mas diversa que se conoce. Se encuentran en todos los organismos aunque son especialmente abundantes y diversos en el reino vegetal, donde desempenan papeles fundamentales en el metabolismo primario y secundario de las plantas. Derivan de un precursor comun el isopentenil difosfato (IPP). La condensacion de tres moleculas de IPP y una de su isomero dimetilalil difosfato (DMAPP) catalizada por la enzima geranilgeranil difosfato (GGPP) sintasa (GGPPS) genera GGPP, un compuesto precursor de isoprenoides plastidicos como carotenoides, giberelinas, plastoquinonas y la cadena fitol de clorofilas, tocoferoles y filoquinonas. El genoma de Arabidopsis thaliana presenta doce genes codificantes para proteinas con homologia a GGPPS, de los cuales solo diez codifican proteinas con actividad GGPP sintasa. Siete isoformas presentan localizacion plastidica, dos se encuentran en el reticulo endoplasmatico y una en la mitocondria. De los genes codificantes, solo tres presentan un patron de expresion ubicuo, mientras que el resto se expresan en tejidos y estadios de desarrollo muy concretos. Estos resultados sugieren que diferentes isoformas de GGPPS podrian estar asociadas a la formacion de isoprenoides especificos. El primer objetivo de esta tesis fue investigar si en la celula vegetal existe una canalizacion de precursores (GGPP) hacia la sintesis de grupos concretos de isoprenoides, y en concreto hacia la sintesis de carotenoides. De las 10 isoformas de Arabidopsis, nuestra investigacion se ha centrado en la isoforma GGPPS11 por ser la unica plastidica de expresion ubicua, alta en tejidos fotosinteticos e inducible por luz, aspectos imprescindibles para estar relacionada con la sintesis de carotenoides. El analisis de tres mutantes de insercion de T-DNA ha revelado que esta isoforma es esencial en la sintesis de isoprenoides y que no presenta redundancia genica con el resto de la familia. La perdida total de funcion GGPPS11 es letal y las semillas homocigotas del alelo ggpps11-3 se abortan como consecuencia de un bloqueo en los primeros estadios del desarrollo embrionario. En el mutante ggpps11-2 el T-DNA esta insertado en la secuencia codificante del peptido de transito a plastos. Hemos demostrado que se traduce una proteina mas corta cuya actividad se ejerce fuera del plasto permitiendo el correcto desarrollo embrionario y dando lugar a plantulas albinas incapaces de desarrollar hojas verdaderas como consecuencia de la ausencia de isoprenoides plastidicos. Por ultimo, el mutante ggpps11-4 de perdida parcial de funcion presenta un fenotipo de plantas mas pequenas y palidas con una reduccion del 20% en los niveles de carotenoides, clorofilas, tocoferoles y plastoquinonas, lo que permite concluir que esta isoforma esta involucrada en la sintesis de la mayoria de los isoprenoides plastidicos derivados del GGPP. Ademas hemos demostrado que GGPPS11 puede interaccionar con varias enzimas que transforman el GGPP en los primeros intermediarios de las rutas que producen estos isoprenoides plastidicos, las enzimas fitoeno sintasa (PSY) hacia carotenoides, geranilgeranil reductasa (GGR) hacia clorofilas y tocoferoles y solanesil difosfato sintasa (SPPS2) hacia plastoquinonas. Proponemos que estas interacciones estarian facilitando la canalizacion de GGPP hacia las correspondientes rutas biosinteticas. El segundo objetivo de esta tesis fue analizar la canalizacion del flujo metabolico hacia la sintesis de carotenoides precursores del ABA en respuesta al estres salino. Hemos demostrado que el unico gen codificante para PSY en Arabidopsis se induce especificamente en la raiz despues de un estres salino para aumentar el flujo hacia la sintesis de carotenoides y que el estres salino tambien provoca una induccion de los genes codificantes para las enzimas que sintetizan los precursores carotenoides (s,s-xantofilas) del acido abscisico (ABA) reconduciendo el flujo de la via hacia la sintesis de la hormona. Isoprenoid represent the functionally and structurally most diverse group of metabolites. They are found in all organisms but are especially abundant and diverse in the plant kingdom, which play key roles in the plant primary and secondary metabolism. Most groups of plastidial isoprenoids derive from geranylgeranyl diphosphate (GGPP), which is produced from universal isoprenoid precursors by the enzyme GGPP synthase (GGPPS). In Arabidopsis thaliana, seven active isoforms have been confirmed to localize in plastids, one in the mitochondria and two in the endoplasmatic reticulum. GGPPS11, the most abundant plastidial isoform in vegetative tissues, has been proposed to be the main enzyme producing GGPP in plastids. Our comprehensive analysis of visual, molecular, and metabolic phenotypes of full and partial ggpps11 loss?of?function mutants has confirmed this hypothesis and established that GGPPS11 produces GGPP for the major groups of plastidial isoprenoids (carotenoids, chlorophylls, tocopherols, and plastoquinones). We also show that the GGPPS11 protein can physically interact with the enzymes that transform GGPP into the first committed intermediates of the pathways for the production of these plastidial isoprenoid metabolites. We propose that multienzyme complexes containing GGPPS11 and particular GGPP?consuming enzymes might facilitate the channeling of GGPP to the corresponding isoprenoid biosynthetic pathways. Furthermore, we demonstrate that GGPPS11 might have an extra?plastidial activity essential for the correct embryo development. As a second objective, we have analyzed the regulation of the carotenoid pathway in response to salt stress. We have demonstrated that the single gene encoding phytoene synthase (PSY), the first committed and flux regulator step or the pathway, in Arabidopsis is specifically induced in the root under salt stress increasing the flow through the synthesis of carotenoids. This stress also leads to the upregulation of other enzymes of the pathway that produce the abscisic acid (ABA) precursors, s,s?xanthophylls. This root specific transcriptional regulation of the pathway promotes the channeling of carotenoid precursors through the synthesis of the hormone under such stress situation.