DnaB Split Intein高表达载体及其介导的环肽库构建

以pET28a为起始质粒，构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码Intc—dnaB—N—IntN片段克隆至pET28a，得到表达载体pEV．在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达；并在split intein介导下发生催化DnaB—N的剪接反应，生成环化的DnaB—N蛋白。将合成的包含随机编码5肽的大小为115bp的片段插入质粒pEVDnaB—N位置，转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽（含5个随机氨基酸和1个Cys）的包含约10^3个克隆的表达载体pEV-IS库。随机挑取20个克隆，测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列；挑取其中9个克隆进行表达，结果表明可产生大量的融合蛋白，90％的融合蛋白在16℃表达20h后发生体内剪接。将在30℃表达3h的融合蛋白用His柱进行纯化，通过MALDI—TOF质谱检测到了目的环肽分子量。