Homéostasie du cuivre dans le chloroplaste : étude comparée de deux transporteurs de la famille des ATPases de type PIB

Le cuivre est un metal de transition essentiel pour le fonctionnement des organismes vivants. Chez la plante Arabidopsis thaliana, la moitie du contenu en cuivre est localise dans le chloroplaste. Cet organite, specifique des cellules vegetales, est constitue d'une enveloppe delimitant le stroma, un compartiment aqueux au sein duquel se trouve un systeme membranaire complexe, les thylacoides. Dans les chloroplastes d'Arabidopsis, le cuivre est le cofacteur de deux proteines essentielles : la superoxyde dismutase Cu/Zn, impliquee dans la defense contre des especes reactives de l'oxygene au niveau du stroma et la plastocyanine, une proteine du lumen des thylacoides, impliquee dans la chaine de transfert des electrons photosynthetiques. Des etudes de genetique inverse ont demontre que le transport du cuivre a la plastocyanine impliquait deux proteines membranaires appartenant a la famille des ATPases-PIB-1 : HMA6, localisee dans l'enveloppe et HMA8, localisee dans la membrane des thylacoides. Une etude fonctionnelle in vitro a montre que HMA6 etait un transporteur de haute affinite de cuivre monovalent presentant les caracteristiques generales des ATPases-P. Afin de comparer les proprietes enzymatiques de ces deux ATPases-PIB-1 et de mieux comprendre leur role respectif dans l'homeostasie du cuivre au sein du chloroplaste, nous avons determine in vitro les proprietes enzymatiques de HMA8.La strategie employee pour la caracterisation de HMA8 a ete similaire a celle utilisee pour la caracterisation de HMA6. Dans un premier temps, la selectivite ionique de HMA8 a ete evaluee a l'aide de tests phenotypiques dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Les proprietes enzymatiques de HMA8 ont ensuite ete determinees in vitro apres expression dans la bacterie Lactoccocus lactis, par des experiences de phosphorylation par l'ATP. Cette analyse a permis de demontrer que HMA8 presentait une plus forte affinite apparente pour le cuivre mais une activite catalytique plus lente que HMA6. L'analyse de modeles tridimensionnels de HMA6 et HMA8 a montre que ces differences pourraient etre expliquees par des differences de charges au niveau de la cavite ou le metal est libere et/ou par la nature des partenaires interagissant avec ces ATPases. Ces differences pourraient expliquer les fonctions distinctes de ces deux transporteurs dans le chloroplaste : HMA6 regulerait la concentration en cuivre dans le stroma en interagissant avec differentes proteines cibles (notamment des chaperonnes a cuivre), alors que HMA8 aurait un role plus precis pour la distribution du cuivre a la plastocyanine.Pour mieux comprendre le mecanisme de liberation du cuivre par HMA6 et HMA8, nous avons effectue une etude fonctionnelle de mutants de la region reliant les deux premieres helices transmembranaires (TMA et TMB). Dans cette etude, nous avons cible les cysteines et histidines qui de par leurs proprietes chimiques sont les residus les plus a meme d'interagir avec le metal. Les mutants d'interets ont ete selectionnes par criblage phenotypique dans la levure puis exprimes dans la bacterie L. lactis. La caracterisation biochimique in vitro de leurs proprietes enzymatiques a ete realisee par des tests de phosphorylation par l'ATP et le Pi. Cette etude nous a permis d'identifier deux residus, une cysteine et une histidine, impliques la liberation du cuivre et de proposer un modele de cheminement du metal dans la partie extracytoplasmique du site de transport de HMA6