Mecanisme d'acció del nou fàrmac antitumoral ARTL0812: rol de la pseudoquinasa TRIB3, l'estrès reticular i els esfingolípids en la mort mediada per autofàgia.

L'ABTL0812 es un derivat lipidic amb activitat antitumoral llicenciat per la companyia biofarmaceutica Ability Pharmaceuticals. En estudis preliminars es va observar que l'ABTL0812 indueix citotoxicitat en un ampli espectre de cel·lules tumorals humanes i una inhibicio del creixement de tumors xenografts derivats de cel·lules tumorals humanes, propietats que han motivat el seu desenvolupament pre-clinic. A l'actualitat, l'ABTL0812 es troba en Fase Clinica 2 en pacients amb cancer de pulmo escamos i d'endometri avancat (identificador ClinicalTrials.gov: NCT03366480). El nostre laboratori esta implicat en caracteritzar el seu mecanisme d'accio antitumoral, utilitzant com a model les cel·lules MiaPaca2 (adenocarcinoma pancreatic) i A549 (adenocarcinoma de pulmo). Estudis previs realitzats al laboratori mostren que l'ABTL0812 activa els receptors PPAR i PPAR, que medien en la induccio de mort dependent d'autofagia sense induir l'aparicio de trets tipicament apoptotics. En aquesta Tesi Doctoral, mitjancant assajos de gen reporter luciferasa, quantificacio de mRNA per RT-qPCR i assaig d'immunoblot, demostrem que l'activacio dels receptors PPAR/ indueix l'activacio transcripcional de la pseudoquinasa TRIB3. Una vegada sobre-expressada, TRIB3 uneix Akt i impedeix la seva activacio per les quinases activadores PDK1 i mTORC2. Com a consequencia d'aixo, s'inhibeix el complex mTORC1. Tanmateix, s'ha constatat que la inhibicio del complex mTORC1 a les cel·lules tumorals humanes MiaPaca2 i A549 no es suficient per induir una autofagia robusta analoga a l'observada per l'ABTL0812. Aquest fet va motivar l'estudi sobre si l'estres reticular podia estar relacionat amb la sobre-expressio de TRIB3 i la mort cel·lular mediada per autofagia induides per l'ABTL0812, tal com s'ha proposat per altres composts anti-tumorals com el tetrahidrocannabinol. En aquest treball hem observat que l'ABTL0812 indueix dilatacio del reticle endoplasmatic i la sobre-expressio dels marcadors d'estres reticular BiP, ATF4 i CHOP. En conjunt, aquests resultats demostren la induccio d'estres reticular per part de l'ABTL0812. El bloqueig farmacologic de l'estres reticular mostra preliminarment que l'estres reticular media en la citotoxicitat induida per l'ABTL0812. D'interes, s'ha posat a punt la quantificacio dels nivells de mRNA plasmatics dels marcador d'estres reticular CHOP i TRIB3, tant en mostres de sang total com a PBMCs purificades, i s'ha constatat que augmenten en els pacients humans en resposta al tractament amb ABTL0812. En l'actualitat, aquests biomarcadors farmacodinamics s'estan utilitzant a la Fase Clinica 2. L'analisi per espectrometria de masses de l'esfingolipidoma de cel·lules tumorals ha permes observar que l'ABTL0812 indueix l'acumulacio de dihidroceramides de cadena llarga, sense alterar els nivells de ceramides. Aquest esdeveniment s'explica pel fet que la incubacio amb ABTL0812 resulta en la inhibicio de l'enzim desaturasa-1 (Des-1) a la cel·lula tumoral. Des-1 es l'ultim enzim de la via de sintesi de novo de ceramides (catalitza el pas de dihidroceramides a ceramides) i la seva inhibicio resulta en l'acumulacio de dihidroceramides de cadena llarga, de manera analoga a la mostrada per l'inhibidor especific de Des-1 GT11. D'interes, el tractament de les cel·lules tumorals amb la dihidroceramida de cadena curta dideuterada d2c8DhCer (que provoca un augment dels nivells cel·lulars de dihidroceramides) resulta en la induccio d'estres reticular, autofagia i citotoxicitat a les cel·lules tumorals MiaPaca2 i A549, tal com fa l'ABTL0812. L'estudi preliminar dels processos executors de la mort cel·lular induida per l'ABTL0812 mostra que aquest compost altera la funcio mitocondrial (deplecio drastica d'ATP cel·lular) i activa la via canonica de mitofagia PINK1/parkina/ubiquitina. A mes a mes, l'ABTL0812 promou l'alliberacio citosolica de catepsines lisosomals, suggerint la induccio de permeabilitzacio de membrana lisosomal (LMP) que explicaria la mort per necrosi observada a les cel·lules tumorals. Finalment, aquesta Tesi proposa que l'ABTL0812 actuaria de forma paral·lela a traves de dos eixos. Per un costat, activaria els receptors PPAR/, que indueixen la sobre-expressio de TRIB3 i la subsequent inhibicio d'Akt i del complex mTORC1. Per l'altre costat, l'ABTL0812 inhibiria l'enzim Des-1, provocant una acumulacio de dihidroceramides de cadena llarga i l'activacio d'estres reticular. Ambdos eixos del mecanisme sinergitzen en l'activacio d'autofagia robusta i mort cel·lular, com demostra el tractament combinat amb l'inhibidor especific de mTORC1 Everolimus i l'inhibidor especific de Des-1 GT11.