Desarrollo de vacunas marcadas con GFP frente a la brucelosis ovina y tests diagnósticos asociados

La brucelosis es una zoonosis extendida mundialmente con importantes repercusiones economicas y santtarias, 1 cuya principal fuente de infeccion para el ser humano son los pequenos rumiantes infectados por Bruce/la melitensis. En gran parte del mundo, ef control de la brucelosis en estos animales debe basarse en la vacunacion. B. melitensis Rev1 es la unica vacuna disponible y recomendada internacional mente para ovejas y cabras. Sin embargo, la vacunacion con Rev1 genera una interferencia serologica que impide la Diferenciacion entre Animales Infectados y \ Vacunados (DIVA), limitando el uso de esta cepa vacuna!. Para tratar de solventar el problema DIVA, se ha desarrollado una tecnica de marcaje xenogenico con la proteina de origen marino GFP. En el Capitulo 1 de esta Tesis, se obtuvieron dos isoformas de GFP recombinante y se desarrollaron tests serologicos utilizando dichas \ proteinas como antigeno diagnostico. En el Capitulo 2, se realizo el marcaje xenogenico de Rev1 con gfp mediante • la insercion cromosomica dirigida de un mini-Tn?-gfp (Rev1::gfp) y un analisis serologico detallado, tanto en ratones BALB/c como en ganado ovino. La estrategia de vacunacion con Rev1::gfp en mezcla con GFP y un booster posterior con GFP en hidroxido de aluminio, permitio identificar durante mas de 6 meses post-booster, a todos los animales que habian sido vacunados, utilizando las tecnicas serologicas oficiales anti-LPS-S y un iELISA-GFP. Ademas, la vacuna clasica Rev1 posee otros inconvenientes como son su poder patogeno residual y resistencia a la 1 estreptomicina, que recomiendan la busqueda de nuevas vacunas frente a B. melitensis. Para ello, en el Capitulo 3 se construyeron y caracterizaron los candidatos vacunales 16Mil.wzm y 16Mil.wzm: :gfp, con LPS-R, a la vez que acumulan PS-0 en el interior bacteriano, y sensibles a estreptomicina. Estas propiedades confirieron una atenuacion y eficacia frente a B. melitens s en ratones similares a las de Rev1. En corderos, la vacunacion combinada de 16Mil.wzm: :gfp con GFP genero una minima interferencia en las pruebas convencionales con LPS-S y permitio identificar a los animales vacunados mediante iELISA-GFP, sin necesidad de booster. j 1. Por otra parte, Rev1 ha permitido controlar la infeccion por Bruce/la av s. En las zonas donde se ha abandonado la vacunacion con Rev1, B. avis es una patogeno emergente que causa graves perdidas economicas. Puesto que no \ existe una vacuna especffica frente a B. avis, el Capitulo 4 se centro en analizar las propiedades vacunales de una seleccion de cinco mutantes rugosos de B. melitensis obtenidos en un proyecto anterior, mediante insercion aleatoria del mini-Tn5. De ellos, se seleccionaron y construyeron por delecion en fase las cepas marcadas 16Mil.wzm::gfp (Capitulo 3) y H38il.wbkF::gfp (Capitulo 4). Ademas, se selecciono un mutante de B. ovis PA que habia mostrado buenas propiedades en el modelo murino en un trabajo anterior, para su marcaje con el mini-Tn?-gfp, generando la cepa BoPAi.\omp10i\.ugpBil.omp31::gfp. La vacunacion con una de estas cepas marcadas, tanto por via intraperitoneal como subcutanea, evidencio mejor proteccion con los mutantes de B. me/itensis que con el triple mutante de B. avis en el modelo murino. Finalmente, se evaluo la inocuidad y respuesta serologica de 16Mil.wzm::gfp y BoPAAomp10i>.ugpBf>.omp31::gfp en ganado ovino, tras la vacunacion combinada del mutante con GFP y posterior booster con GFP en hidroxido de aluminio, siguiendo el protocolo descrito en el Capitulo 2. Al igual que con '\ Rev1::gfp, esta estrategia permitio identificar por iELISA-GFP a todos los animales que habian sido vacunados, , durante mas de 4 meses post-booster. En conjunto, por un lado, el marcaje de Bruce/la con el mini-Tn7-gfp permitio conservar las propiedades microbiologicas y vacunales que poseian los correspondientes mutantes antes de ser marcados y, a su vez, permitio identificarlos facilmente por visualizacion directa de la ftuorescencia y por u_na PCR-GFP multiple espcificamente disenada. Por otro lado, Rev1::gfp y 16ML'lwzm::gfp parecen buenas alternativas a Rev1 frente a tnfecctones por B.