Estudio químico de bacterias de origen marino: aislamiento de productos naturales bioactivos, proteínas recombinantes receptoras de sideróforos de bacterias patógenas en peces de acuicultura y síntesis de conjugados de sideróforos con nanopartículas magnéticas

espanolEsta Tesis Doctoral esta dividida en tres partes. En la primera parte, se describe la importancia de los sistemas de captacion de hierro en bacterias patogenas de peces y el uso de proteinas receptoras de sideroforos como potenciales vacunas. En la segunda parte, se sintetizo un conjugado entre el sideroforo feroxamina y nanoparticulas magneticas y se realizaron ensayos de captura con Yersinia enterocolitica WC-A. Finalmente, se determino la estructura plana y la estereoquimica del tetrapeptido cereusitin A producido por Bacillus cereus RKHC-09 y se detecto e identifico el complejo de Ga(III) de piscibactina en los sobrenadantes de los cultivos de Vibrio anguillarum RV22 y el mutante vabF, con el fin de establecer la importancia del sistema de capatacion de hierro mediado por piscibatina en la viruencia de V. anguillarum. Capitulo I En este capitulo se habla de la importancia de la acuicultura y la necesidad de desarrollar nuevos tratamientos para el control de infecciones producidas por bacterias patogenas. Ademas, se describe de forma general el mecanismo de captacion de hierro y las ventajas de emplear proteinas de membrana externa receptoras de sideroforos como vacunas. Se presenta la metodologia de clonaje, expresion y purificacion de las proteinas recombinantes FvtA (receptor del sideroforo vancrobactina producido por Vibrio anguillarum RV22) y FstC (receptor de los sideroforos amonabactinas biosintetizados por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Adicionalmente, se expreso y purifico rFstB (receptor de acinetobactina producido por A. salmonicida subsp. salmonicida VT45). Finalmente, se muestran los resultados obtenidos al ensayar rFvtA, rFstB y rFstC como vacuna en lenguados infectados con vibriosis y forunculosis. Capitulo II Este capitulo esta dedicado a la aplicacion de sideroforos conjugados con nanoparticulas magneticas para el desarrollo de un mecanismo de deteccion de bacterias. Se describen las aplicaciones de los sideroforos en diferentes campos junto con el proceso de diseno de nanomateriales magneticos y la versatilidad de estos para sintetizar conjugados para desarrollar aplicaciones. RESUMEN ii Se describe la sintesis del conjugado entre el sideroforo feroxamina y nanoparticulas magneticas funcionalizadas (MNP@SiO2@NH@Fa), su caracterizacion y su capacidad de captura de Yersinia enterocolitica WC-A. Tambien, se muestra la sintesis de un analogo de enterobactina que puede ser empleado para la sintesis de conjugados. Capitulo III En este capitulo se hace una breve introduccion de la importancia de los microorganismos marinos como productores de productos naturales, su actividad biologica y su gran diversidad estructural. Tambien se expondran los metodos mas generales para la seleccion de condiciones para el cultivo y obtencion de compuestos producidos por bacterias principalmente. Se muestra el proceso de elucidacion estructural del tetrapeptido cereusitin A producido Bacillus cereus RKHC-09 mediante experimentos de resonancia magnetica nuclear mono y bidimesionales y analisis de espectrometria de masas de baja y alta resolucion. Adicionalmente, se determino la estereoquimica absoluta de los aminoacidos presententes en la molecula por medio del metodo de Marfey. Finalmente se mostrara el proceso de deteccion del complejo de Ga(III) de piscibactina en el sobrenadante de cultivo de V. anguillarum RV22 y el mutante vabF por medio de cromatografia liquida acoplada a espectrometria de masas (LCMS). EnglishThis Doctoral Thesis is divided into three parts. The first part describes the importance of iron uptake systems in fish pathogenic bacteria and the use of siderophore-receptor proteins as potential vaccine candidates. In the second part, the synthesis of a conjugate of feroxamine siderophore and magnetic nanoparticles is shown as an attempt to create a new surface able to capture Yersinia enterocolitica WC-A. Finally, in chapter III the structural and stereochemical determination of the tetrapeptide cereusitin A is described as well as the detection and identification of the piscibactin-Ga(III) complex in the supernatants of the cultures of Vibrio anguillarum RV22 and its vabF mutant. Furthermore, the piscibactin is shown as an important molecule in the iron uptake system and the virulence of V. aguillarum. Chapter I This chapter discusses the importance of aquaculture and the need to develop new treatments for the control of infections produced by pathogenic bacteria. In addition, the mechanism of iron uptake along with the advantages of using siderophores receptor outer membrane proteins as vaccines candidates is described broadly. Here are presented the methodology of cloning, expression and purification of the recombinant proteins FvtA (receptor of the siderophore vancrobactin produced by Vibrio anguillarum RV22) and FstC (receptor of the siderophores amonabactin biosynthesized by Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Additionally, the expression and purification of rFstB protein (acinetobactin receptor produced by A. salmonicida subsp. salmonicida VT45) is shown. Finally, the results obtained when testing rFvtA, rFstB and rFstC as a vaccine in flounders infected with vibriosis and forunculosis are presented. Chapter II This chapter is dedicated to the application of siderophores and magnetic nanoparticles to the study of a bacterial detection mechanism. The applications of siderophores in different fields are described along with the design process of magnetic nanomaterials and its versatility and capability in the conjugate synthesis to develop applications. The synthesis of the conjugate of feroxamine and functionalized magnetic nanoparticles (MNP@SiO2@NH@Fa), its characterization and capture capacity towards Yersinia enterocolitica WC-A are described. Also, the synthesis of an enterobactin analogue that can be used for the synthesis of conjugates is shown. Chapter III In this chapter is made a brief introduction of the importance of marine microorganisms as producers of natural products, their biological activity and their great structural diversity. Also, the most general methods for the selection of culture conditions in the obtainment of compounds mainly produced by bacteria are exposed. The structural elucidation process of the tetrapeptide cereusitin A produced by Bacillus cereus RKHC-09 is shown by mono and bidimensional nuclear magnetic resonance experiments as well as low and high resolution mass spectrometry analysis. Additionally, absolute stereochemistry was determined by means of the Marfey’s method. Finally, here is shown the procedure developed for the detection of piscibactin- Ga(III) complex from culture supernatant of V. anguillarum RV22 and its vabF mutant by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). galegoEsta Tese Doctoral esta dividida en tres partes. Na primeira parte, describese a importancia dos sistemas de captacion de ferro en bacterias patoxenas de peces e o uso de proteinas receptoras de sideroforos como potenciais vacinas. Na segunda parte, sintetizouse un conxugado entre o sideroforo feroxamina e nanoparticulas magneticas e realizaronse ensaios de captura con Yersinia enterocolitica WC-A. Finalmente, determinouse a estrutura plana e a estereoquimica do tetrapeptido cereusitin A producido por Bacillus cereus RKHC-09 e detectouse e identificouse o complexo de Ga(III) de piscibactina nos sobrenadantes dos cultivos de Vibrio anguillarum RV22 e o mutante vabF. Capitulo I Neste capitulo falase da importancia da acuicultura e a necesidade de desenvolver novos tratamentos para o control de infeccions producidas por bacterias patogenas. Ademais, describese de forma xeral o mecanismo de captacion de ferro e as vantaxes de empregar proteinas de membrana externa receptoras de sideroforos como vacunas. Presentase a metodoloxia de clonaje, expresion e purificacion das proteinas recombinantes FvtA (receptor do sideroforo vancrobactina producido por Vibrio anguillarum RV22) e FstC (receptor dos sideroforos amonabactinas biosintetizados por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Adicionalmente, expresouse e purifico rFstB (receptor de acinetobactina producido por A. salmonicida subsp. salmonicida VT45). Finalmente, mostranse os resultados obtidos ao ensaiar rFvtA, rFstB e rFstC como vacuna en lenguados infectados con vibriosis e forunculosis. Capitulo II Este capitulo esta dedicado a aplicacion de sideroforos e nanoparticulas magneticas para o desenvolvemento dun mecanismo de deteccion de bacterias. Describense as aplicacions dos sideroforos en diferentes campos xunto co proceso de deseno de nanomateriales magneticos e a versatilidad destes para sintetizar conxugados para desenvolver aplicacions. Describese a sintese do conxugado entre o sideroforo feroxamina e nanoparticulas magneticas funcionalizadas (MNP@SiO2@NH@Fa), o seu caracterizacion e a sua capacidade de captura de Yersinia enterocolitica WC-A. Tamen, mostrase a sintese dun analogo de enterobactina que pode ser empregado para a sintese de conxugados. Capitulo III Neste capitulo faise unha breve introducion da importancia dos microorganismos marinos como productores de produtos naturais, a sua actividade bioloxica e o seu gran diversidad estructural. Tamen se exponeran os metodos mais xerais para a seleccion de condicions para o cultivo e obtencion de compostos producidos por bacterias principalmente. Mostrase o proceso de elucidacion estructural do tetrapeptido cereusitin A producido Bacillus cereus RKHC-09 mediante experimentos de resonancia magnetica nuclear mono e bidimesionales e analise de espectrometria de masas de baixa e alta resolucion. Adicionalmente, determinouse a estereoquimica absoluta por medio do metodo de Marfey. Finalmente mostrasese o proceso de deteccion do complexo de Ga(III) de piscibactina no sobrenadante de cultivo de V. anguillarum RV22 e o mutante vabF por medio de cromatografia liquida acoplada a espectrometria de masas (LC-MS).