SHP-2酪氨酸磷酸酶野生、突变型真核表达载体构建及其表达产物磷酸酶活性检测

目的构建pcDNA3．1SHP-2野生型（wT）及SHP．2^D61G突变型（MT）真核表达载体，为研究SHP-2激活突变对肿瘤恶性生物学行为的影响提供基础。方法用RT—PCR及定点突变法从小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中扩增出目的片段，双酶切后定向连入pcDNA3．1载体，构建pcDNA3．1SHP-2野生型及SHP_2^D61G/＋真核表达质粒，经酶切、测序检测其构建的准确性；Westernblot法检测转染NIH3T3细胞中SHP-2蛋白的表达水平；免疫共沉淀法获得表达在NIH3T3细胞中的SHP-2蛋白，用pNPP法检测其磷酸酶活性。结果构建的pcDNA3．1SHP-2野生型及SHP_2^D61G突变质粒经酶切初步检测后，测序检测发现MTSHP-2在181位核苷酸由wT的G突变为T，转染NIH3T3细胞株能够表达SHP-2蛋白；且转染MT的NIH3T3细胞株内SHP-2磷酸酶活性较wT组升高2倍（P〈0．01）。结论成功构建了pcDNA3．1SHP-2野生型及SHP-2^D61G突变型真核表达载体，SHP-2^D61G突变的蛋白磷酸酶活性升高。