Untersuchungen zur Produktion und Chaperoninteraktion von Yersinia YopE und SycE mittels Reporterfusionstechnologie

Yersinia enterocolitica produzieren Pathogenitatsfaktoren, die es ihnen ermoglichen, an die Zellen des Wirtes zu adharieren, diese zu invadieren und protektive Immunantwort des Wirtes zu modifizieren. Dazu gehoren die Yersinia outer proteins (YOP), die durch den Typ III Sekretionsweg uber die Bakterienmembran in die Wirtszelle transloziert werden. Diese Sekretion wird durch das Chaperon SycE unterstutzt. SycE bindet an YopE, verhindert die Degradation, stabilisiert die Faltung des Proteins und leitet es an die Sekretionspore. Mittels Reporterfusionstechnologie mit GFP und BFP sollte durch einen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), bei dem die Fluoreszenzenergie von BFP strahlenlos auf GFP ubertragen wird wenn beide Proteine in einer Distanz von 1-10 nm liegen, die Interaktion der beiden Proteine intrazellular dargestellt werden. Es wurden verschieden lange Yop-Fragmente mit dem Reprotergen gfp und SycE mit BFP fusioniert. Ferner sollte mit Hilfe der Reportergene gfp und luc die Produktion von YopE und SycE in vitro verfolgt werden. Zusammenfassend ist die Darstellung der Interaktion mittels FRET schwierig, da mikroskopisch eine erwartete Grunfluoreszenz gezeigt werden konnte, die Negativkontrollen aber durch die Eigenschaften der Reporterproteine nicht eindeutig negativ waren. Desweiteren zeigt sich eine hohe Ausbleichrate von BFP, ferner uberlappt sich das Emissionsspektrum von BFP und GFP in einem grossen Bereich, sodass es unabhangig von einem moglichen FRET von BFP zum Auftreten einer entsprechenden Grunfluoreszenz aufgrund der Anregung durch die Lichtquelle kommen kann. Im zweiten Teil zeigt sich, dass die Produktion von YopE und SycE kontinuierlich stattfindet und mit dem Beginn der in vitro Stimulation produziert werden, mit einem Verhaltnis deutlich zugunsten von SycE. Diese Ergebnisse sprechen fur ein Modell der Chaperon-induzierten, posttranslationalen Sekretion von YopE. Gleichzeitig ist durch die hohe Stabilitat von GFP die fluoreszenzmikoskopische Bestimmung der Produktionskinetiken von YopE-GFP und anderen Proteinen begrenzt.