蓝藻Synechococcus elongatus PCC7 942荧光实时定量RT-PCR实验体系的优化

蓝藻(Synechococcu elongatus PCC 7942)是最简单的原核生物钟模式生物,研究其生物钟基因表达模式具有重要的科学意义.然而由于该蓝藻高质量RNA提取困难,目前应用荧光实时定量RT-PCR(qPCR)实验方案对其特定基因表达模式进行研究的报道较少.研究尝试通过对影响RNA提取质量的溶菌酶作用时间、起始细胞数量等因素,以及对影响qPCR反应特异性和重现性的cDNA模板浓度、引物浓度、引物退火温度等条件进行优化,初步建立了一套适用于S.elongatus PCC 7942 的qPCR实验体系.结果表明震荡培养至OD750≈0.4时,取10mL蓝藻细胞起始提取实验,使用3mg/mL溶菌酶处理10min后,再经试剂盒法提取总RNA的策略,RNA得率最高且质量最好.蓝藻的qPCR优化结果显示cDNA终质量浓度0.1μg/μL,引物终浓度4pmol/L,并根据引物对Tm值调整退火温度是最佳反应条件.