Lipase-catalysed synthesis of glycolipids - utilization of innovative media, reactors and substrates -

Glykolipide sind vielversprechende nichtionische Tenside mit einem breiten Anwendungsspektrum. Man begegnet ihnen taglich in Reinigungsmitteln, Pharmazeutika oder auch in Lebensmitteln. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit und Prasenz in Hygieneprodukten steigt die Nachfrage weltweit kontinuierlich an. Die etablierte chemische Synthese von Glykolipiden weist einige Nachteile wie mangelnde Spezifitat und Selektivitat auf. Im Gegensatz zu den traditionellen Tensiden fossilen Ursprungs weisen sie nicht nur hervorragende Tensid- und Emulgiereigenschaften auf, sondern sind auch biologisch abbaubar und nicht toxisch fur die Umwelt. Glykolipide konnen durch mikrobielle Fermentation, durch chemische oder enzymatische Synthese unter Verwendung erneuerbarer Ressourcen hergestellt werden. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir unter Verwendung von Lipasen, dass die Esterbildung unter milden und nahezu wasserfreien Bedingungen erreicht werden kann, wobei letztere erforderlich sind, um die Kondensation anstelle der Hydrolysereaktion zu begunstigen. So wurde unter Verwendung von Losungsmitteln mit geringer Wasseraktivitat der enzymatisch synthetisierte Zuckeralkoholester, Sorbitollaurat, als Modellprodukt verwendet. Folglich hebt diese Dissertation die enzymatische Synthese als Methode der Wahl fur die masgeschneiderte Herstellung einer potenziell breiten Palette von neuartigen Tensiden hervor. Die Biokatalyse ermoglichte eine innovative Herangehensweise an dieses aktuelle Thema mit einem multidisziplinaren Ansatz im Hinblick auf die aktuellen Bedenken zur Nachhaltigkeit. Die Loslichkeit von Polyolen wie Zuckern oder Zuckeralkoholen in organischen Losungsmitteln ist eher gering. Die enzymatische Synthese dieser Verbindungen ist jedoch in nahezu wasserfreien Medien unter Verwendung kostengunstiger und nachwachsender Rohstoffe moglich. Mit Hilfe von Lipasen kann die Esterbildung unter milden Bedingungen erreicht werden. Wir schlagen zunachst ein "2-in-1"-System vor, das die Loslichkeitsprobleme uberwindet, da ein Deep Eutectic System (DES) aus Sorbitol und Cholinchlorid entweder ein rein organisches oder wassriges Medium ersetzt. Erstmals wurden 16 kommerziell erhaltliche Lipase-Formulierungen verglichen und Faktoren, die den Umsatz beeinflussen, untersucht, um diesen Prozess dank einer neu entwickelten HPLC-ELSD-Methode zur Quantifizierung zu optimieren. So konnte bei der optimierten Synthese von Sorbitollaurat (SL) unter Verwendung von 50 g/L der Lipaseformulierung Novozym 435® bei 50°C eine 28%ige molare Umsetzung von 0,5 M Vinyllaurat zu seinem Zuckeralkoholmonoester erreicht werden, wenn das DES 5 Gew.-% Wasser enthielt. Nach 48h wurde das de novo synthetisierte Glykolipid durch Flussig-Flussig-Extraktion vom Medium abgetrennt, durch Flash-Chromatographie gereinigt und durch ein- und zweidimensionale Kernspinresonanz (NMR)-Experimente und Massenspektrometrie (MS) charakterisiert. Abschliesend erbringen wir einen ersten Nachweis der Skalierbarkeit fur diesen Prozess. Die Verwendung eines 2,5-L-Ruhrkesselreaktors (STR) ermoglichte eine Batch-Produktion bis zu 25 g/L in einem hochviskosen Zweiphasensystem. Dennoch bleiben viele Herausforderungen bestehen und begrenzen die Erwartungen an eine industrielle Anwendung. Eine lange Produktionszeit und relativ niedrige Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten gehoren zu den Barrieren, die es zu uberwinden gilt. Wir konzentrierten uns in diesem Zusammenhang auf die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten bei der Herstellung von Sorbitollaurat durch eine mikrowellenunterstutzte Methode, die wir jedoch mit einer konventionellen Heizmethode verglichen. Es wurden auch verschiedene Losungsmittelsysteme miteinander konkurriert, wobei sich 2M2B als ein leistungsfahigeres Losungsmittelsystem als das DES erwies. So erlaubte die Verwendung von 20 g/L immobilisierter Lipaseformulierung, 0,75 M Vinyllaurat, 0,25 M Sorbitol bei 50°C in 2M2B eine 92%ige Konversionsausbeute zu erreichen, was einer 168 g/L Titerproduktion entspricht. Der Einsatz der Mikrowellentechnologie ermoglichte danach eine 50-fache Steigerung der ursprunglichen Reaktionsgeschwindigkeit im organischen Losungsmittel bei 75°C. Die Wiederverwendung des Biokatalysators wurde auch in 2M2B und DES untersucht, wobei bei letzterem eine grosere Destabilisierung des Enzyms festgestellt wurde. Wir bringen somit eine Nuance in die intensive Entwicklung, die DESs derzeit in der Literatur als Medium fur die Biokatalyse erfahren. Nichtsdestotrotz zeigen wir ermutigende Aussichten auf Verbesserungen, um DESs konkurrenzfahig zu Standardmedien fur Biokonversionen zu machen. Abschliesend untersuchten wir die Effizienz unseres Downstream-Prozesses, der die vollstandige Ruckgewinnung von Sorbitollaurat nach 4 Zyklen der Flussig-Flussig-Extraktion ermoglicht. Bestehende Berichte, die integrierte Prozesse zur Glykolipidproduktion aus nachwachsenden Rohstoffen beschreiben, verwenden viele Reaktionsschritte. Daher zielten wir darauf ab, das Verfahren zu vereinfachen. Durch die Verwendung von dielektrischer Mikrowellenerwarmung wurde die Herstellung von DESs zunachst erheblich beschleunigt. Unsere Vergleichsstudie ergab eine durchschnittlich 16-fach schnellere Vorbereitungszeit als die konventionelle Erhitzungsmethode in einem Inkubator. Daruber hinaus konnten Lipide aus robuster olhaltiger Hefe-Biomasse erfolgreich bis zu 70% extrahiert werden, ohne die Vorbehandlungsmethode fur den Zellaufschluss zu verwenden, wodurch der fur einen solchen Prozess notwendigen Energieaufwand begrenzt. Angesauerte DESs, die entweder aus Xylit oder Sorbit und Cholinchlorid bestanden, vermittelten den Eintopfprozess und ermoglichten die anschliesende Umwandlung der Lipide in monoacylierte Palmitat-, Oleat-, Linoleat- und Stearat-Zuckeralkoholester. Somit zeigen wir, dass die Zugabe von immobilisierter Candida antarctica Lipase B (Novozym 435®) in einer angesauerten DES-Mischung eine vereinfachte und schnelle Glykolipidsynthese unter Verwendung direkt olhaltiger Hefebiomasse ermoglicht. Schlieslich stellen wir fest, dass der DES-ahnliche Manuka-Honig auch als Medium fur die Glykolipidsynthese dienen kann. Diese ubersattigte Zuckerlosung kann in Bezug auf die physikochemischen Eigenschaften mit den zuckerbasierten DESs verglichen werden. Da Honigprodukte fur therapeutische Zwecke kommerziell verfugbar sind, erscheint es interessant, ihre Bioaktivitat zu erhohen. Im letzten Kapitel dieser Dissertation wird untersucht, ob die Anreicherung von medizinischem Honig mit in situ enzymatisch synthetisierten Glykolipiden die antimikrobielle Eigenschaft der Mischung verbessern kann. Die getesteten Mischungen bestehen aus Manuka-Honig, der mit Octanoat-, Decanoat-, Laurat- und Myristat-Zuckerestern angereichert ist, die jeweils als GOH, GDH, GLH und GMH bezeichnet werden. Um die Bioaktivitat dieser Mischungen zu charakterisieren, wurde zunachst ein qualitatives Screening mittels Agar-Well-Diffusionstest mit Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida bombicola, Escherichia coli und Pseudomonas putida durchgefuhrt, das eine deutlich erhohte Empfindlichkeit dieser Mikroorganismen gegenuber den verschiedenen mit Glykolipiden angereicherten Honigmischungen bestatigte. Dann wurde ein entworfener Biosensor E. coli-Stamm verwendet, der ein Stressreportersystem aufweist, das aus drei stressspezifisch induzierbaren, rot, grun und blau fluoreszierenden Proteinen besteht, die jeweils physiologischen Stress, Genotoxizitat und Zytotoxizitat ubersetzen. Letzteres ermoglichte die Charakterisierung der Bioaktivitat und zeigte eine sechsfache Steigerung des physiologischen Stresses durch GOH im Vergleich zu regularem Manuka-Honig bei einer Konzentration von 1,6% (v/v). Der antibakterielle Agar-Well-Diffusionstest mit E. coli wurde dann durchgefuhrt und zeigte ein verbessertes hemmendes Potential mit GOH bei 20% (v/v) Konzentration.