Biochemical, biophysical, and thermal properties of alkaline phosphatase from thermophile Thermus sp. NTU-237

Proprietes biochimiques, biophysiques et thermiques de la phosphatase alcaline de la souche thermophile Thermus sp. NTU-237Description du sujet. Les phosphatases alcalines (APases) sont frequemment employees comme marqueurs non radioactifs pour la detection specifique de proteines ou d’ADN cibles en medecine clinique et en biologie moleculaire. Toutefois, leur application en biotechnologie industrielle necessite une bonne stabilite tant thermique que de conservation. Nos recherches preliminaires ont montre que l’APase de Thermus sp. NTU-237 (TsAPase) est thermostable et presente une haute activite. Il est donc interessant d’etablir les conditions optimales de son emploi.Objectifs. Caracteriser l’APase de la souche thermophile Thermus sp. NTU-237 et evaluer ses potentialites d’application.Methode. Le gene de l’APase de Thermus sp. NTU-237 a ete clone pour etre exprime dans Escherichia coli. Cela a permis l’etude des effets sur l’activite enzymatique TsAPase, de la temperature, du tampon, des teneurs en glycerol, en dodecyl sulfate de sodium (SDS) et en NaCl pour cerner les conditions optimales d’essai. De plus, les potentialites d’application des TsAPase ont ete investiguees au moyen du substrat chromogene 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro bleu de tetrazolium (BCIP/NBT).Resultats. La TsAPase recombinante fonctionne comme un dimere d’une masse moleculaire de 109 kDa. Les alignements de sequences de la TsAPase avec d’autres APases thermophiles connues et l’APase d’E. coli denotent une bonne conservation des acides amines impliques dans l’activite catalytique et dans des fonctions de liaison a certains residus. Cette decouverte suggere que le mecanisme catalytique des TsAPases est identique a celui d’autres APases. L’activite TsAPase s’est averee etre inhibee par le glycerol et le SDS, alors qu’elle s’est accrue en presence de NaCl et de tampon Tris-HCl. Les parametres cinetiques Km, kcat, et Vmax ont ete etablis a 81 µM, 6,08 s-1 et 6,76 U·mg-1, respectivement. La temperature optimale de la TsAPase etait de 80 °C. La TsAPase est stable a temperature ambiante durant plus de 10 jours. De plus, la TsAPase s’est montree capable de catalyser la dephosphorylation du BCIP, provoquant par la meme occasion le developpement a temperature ambiante de la couleur bleue du substrat transforme. Conclusions. Les resultats rapportes illustrent les potentialites d’utilisation de la TsAPase, que ce soit dans le domaine medical ou en recherche fondamentale.