欧洲玉米螟 ( Ostrinia nubilalis ) 幼虫肠道表达序列标签:探究候选基因与苏云金芽孢杆菌毒素和抗性潜在的关联

背景 目前，鳞翅目类昆虫已经超过16 000种，其中包括一些对农作物、森林以及储存物最具破坏性的害虫。然而，我们对鳞翅目昆虫基因组信息的了解却十分有限，只有极少数的科学研究将重点放在构建鳞翅目昆虫幼虫肠道表达序列标签文库上。对昆虫肠道的基因表达的认识是了解食物消化基本生理学的关键，通过探索它们与苏云金芽孢杆菌相互作用的类型、方式等，可以找到新毒素的新靶标进而用于控制害虫。欧洲玉米螟(ECB, Ostrinia nubilalis )是北美和西半球作物生产中对玉米危害最大的害虫之一，本研究所分析的表达序列标签来自于ECB的幼虫肠道中。我们的研究目的是建立一个欧洲玉米螟幼虫肠道的特异性表达序列标签数据库，作为未来研究的基因组资源，同时从欧洲玉米螟中发掘与Bt相互作用和对Bt产生抗性的潜在的相关联的候选基因。 结果 我们用欧洲玉米螟5龄幼虫的肠道作为材料，构建了两个cDNA文库，并从这两数据库中通过测序，总共获得了15 000个EST序列。在获得的EST序列中，共有12 519 (83.4%)个ESTs为高质量片段，平均长度为656 bp。这些ESTs象征着有2 895个特异性序列，这些特异性列中包括1 738个单体和1 157个重叠群。在这些特异性序列中，62.7%编码假定蛋白质，这些假定蛋白的序列与Genbank数据库已有可用于比对的序列有重要的相似性(E-value ≤ 10 -3 )。我们对EST分析表明有52个候选基因可能在Bt毒性和抗性中的作用中扮演角色。这些基因编码了18种胰蛋白酶，18种糜蛋白酶，13种氨基肽酶，2种碱性磷酸酶以及一种钙粘着蛋白。我们利用RT-PCR的方法比较对Cry1Ab敏感系和具抗性虫系的欧洲玉米螟中的41个候选基因的表达谱，实验结果表明，与敏感虫系相比，抗性虫系中的2种胰蛋白酶基因和2种糜蛋白基因和一种氨基肽酶基因表达量下降明显。相反，在抗系虫系中3个胰蛋白酶基因，3个糜蛋白酶基因，2个氨肽酶基因以及2个碱性磷酸酶基因的的表达量增加。候选基因如此大的表达差异可能说明它们与Cry1Ab抗性之间存在关联。实际上，在先前研究中已经发现了一些胰蛋白酶和糜蛋白酶可以激活或抑制Bt的原毒素和毒素。然而，在其它一些昆虫种类体内，一些氨肽酶，钙粘着蛋白以及碱性磷酸酶已经被证实是作为Bt的毒素蛋白受体。 结论 我们利用从欧洲玉米螟幼虫的肠道中获得的15 000个cDNA构建了一个相对比较大的EST数据库，该数据库由12 519个高质量的序列组成。据我们了解，该数据库是鳞翅目害虫中最大的肠道特异性EST数据库。我们的研究也为以后欧洲玉米螟肠道特异性DNA基因芯片的开发、利用等研究奠定基础，而这种基因芯片可以用来分析Bt原毒素/毒素的基因表达的整体变换以及Bt抗性虫系和感性虫系之间的遗传差异。此外，我们鉴定了52个可能与Bt的毒性和抗性有关的候选基因。通过RT-PCR检测，我们从获得的41个候选基因选出15个有表达差异的基因，其中有5个基因在Cry1Ab抗性虫系中是表达量减少，而其余10个基因是表达量增加。这些结果可能会使我们坚信这些候选基因与Bt抗性有关，并为探讨cry1Ab在欧洲玉米螟中的抗性机制提供了新的观点。