基于基因过表达及基因沉默解析 F5H 基因对甘草酸生物合成的调控研究

阿魏酸5-羟化酶（ferulate 5-hydroxylase，F5H）是苯丙烷代谢途径上的关键酶。本课题组前期转录组测序研究显示F5H基因在甘草酸生物合成过程中起负调控作用，因此本文拟克隆该基因，并从基因过表达和沉默两个方面对这一调控作用进行深入研究。本文克隆得到甘草F5H基因（GenBank注册号：MK882511）；以pCAMBIA1305.1为载体骨架，以Spe Ⅰ和Bgl Ⅱ为酶切位点，利用基因融合法构建过表达载体pCA-F5H；根据F5H第一外显子设计sgRNA序列，以pHSE401为载体骨架，以Bsa Ⅰ为酶切位点，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pHSE-F5H；使用电转法将pCA-F5H和pHSE-F5H分别转入发根农杆菌ATCC15834感受态细胞；以甘草胚轴为外植体材料，利用发根农杆菌介导法分别诱导F5H过表达及沉默甘草毛状根系。同时，构建野生型甘草毛状根以及携带空质粒的阴性对照甘草毛状根。利用UPLC法测定各甘草毛状根系中甘草酸的含量，结果显示F5H基因沉默甘草毛状根体系中甘草酸含量显著高于野生型和阴性对照组，而过表达F5H基因甘草毛状根系中甘草酸含量则显著低于野生型和阴性对照组。本文通过逆向遗传学策略，从基因过表达和沉默两个方面证实了F5H基因对甘草酸生物合成的负调控作用，为进一步构建甘草酸次生代谢分子调控网络奠定了基础。