Configuración de una estrategia para la identificación genético-molecular de pacientes con enfermedad mitocondrial

Las enfermedades mitocondriales (EM) son un grupo de enfermedades hereditarias del metabolismo, caracterizadas por la alteracion de la funcion mitocondrial, que en la mayor parte de los casos se deben a trastornos del sistema de la fosforilacion oxidativa. Este grupo de enfermedades es muy heterogeneo tanto clinica como geneticamente, debido a su origen genetico dual (pueden producirse por mutaciones tanto en el genoma nuclear como en el genoma mitocondrial) y a su gran variabilidad fenotipica (puede estar afectado un solo organo o la afectacion puede ser multisistemica). En estas enfermedades, en muchas ocasiones no hay correlacion genotipo-fenotipo, una misma mutacion produce fenotipos distintos, y mutaciones en distintos genes producen el mismo fenotipo. Este hecho dificulta el diagnostico genetico de estas enfermedades. La hipotesis de esta tesis es que la aplicacion de las tecnicas de secuenciacion masiva (NGS) en el diagnostico de las EM mejorara la eficacia de su diagnostico. La aplicacion de la NGS en estas enfermedades podra detectar nuevas variantes patogenicas en genes conocidos, asociar nuevos fenotipos a genes ya descritos implicados en EM, asi como descubrir nuevos genes causantes de estas enfermedades ampliando el espectro feno-genotipico, asi como optimizar el rendimiento diagnostico. En este trabajo se ha integrado la secuenciacion masiva en el diagnostico de pacientes con EM, tanto en la secuenciacion del genoma mitocondrial como en genes nucleares. Se ha puesto a punto y validado la secuenciacion del ADN mitocondrial (ADNmt) completo, que ha permitido detectar bajos niveles de heteroplasmia del ADNmt. Ademas, se ha optimizado la homogeneidad de la cobertura en toda la molecula del ADNmt. Esta metodologia ha permitido delimitar en los casos de deleciones unicas del ADNmt la region delecionada. Se ha disenado y validado un panel de genes a la carta, relacionados con el mantenimiento del ADNmt para su uso diagnostico. En pacientes con EM tambien se ha estudiado el exoma clinico (n=8) y el exoma completo (n=9). Se han caracterizado las nuevas variantes potencialmente patogenicas encontradas, tanto en el ADN mitocondrial como en genes nucleares y se han estudiado posibles variantes modificadoras del fenotipo en pacientes con sordera neurosensorial no sindromica portadores de la variante m.1555A>G en MTRNR1 en homoplasmia. La aplicacion de las tecnicas de secuenciacion masiva en el diagnostico de estas enfermedades ha obtenido un alto rendimiento diagnostico, sobre todo en aquellos enfermos bien caracterizados clinicamente. La secuenciacion del ADNmt ha permitido la deteccion de variantes patogenicas en muy bajo porcentaje de heteroplasmia, no detectadas por secuenciacion Sanger, en muestras de ADN procedente de sangre periferica, hecho que ha permitido el diagnostico de estos pacientes sin necesidad de realizar una biopsia muscular. El estudio de secuenciacion del ADNmt completo ha detectado variantes patogenicas no asociadas previamente a los fenotipos de los pacientes. La aplicacion del panel de genes relacionados con el mantenimiento del ADNmt ha tenido un buen rendimiento sobre todo en los pacientes que presentaban deleciones multiples del ADN mitocondrial, siendo el gen POLG en el que se han encontrado en mayor proporcion en estos pacientes. El estudio del exoma clinico en pacientes que presentaban sindrome de Leigh ha permitido diagnosticar geneticamente a 2 de los 6 pacientes estudiados. En dos de los pacientes estudiados con exoma con deficit multienzimatico del sistema de fosforilacion oxidativa se han encontrado variantes posiblemente patogenicas. En un paciente en un gen previamente descrito asociado a fenotipo clinico (YARS2) y en el otro paciente en un gen mitocondrial de funcion conocida no asociado hasta el momento a patologia. Ademas, en algunas de las nuevas variantes encontradas, se ha podido caracterizar funcionalmente su patogenicidad, asociandolas al fenotipo del paciente.