海带配子体γ-碳酸酐酶(CA)的基因克隆与功能鉴定

本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)等技术获得海带配子体细胞一个γ-亚型碳酸酐酶(CA)基因的cDNA及DNA全长序列。其cDNA长为1 618 bp，编码由305个氨基酸组成的蛋白；DNA长为11 812 bp，具6个内含子，将开放阅读框(ORF)分割成7个外显子；其具有一个gamma-CA的结构域，并具有一个独特的左手平行β-螺旋结构域；由36个CA的氨基酸序列所构建的邻接和最大似然聚类图显示，该CA与其他物种的γ-CA聚为一支。因而，将该克隆的基因命名为Sjγ-CA。为了解其编码蛋白的功能，将Sjγ-CA的ORF亚克隆至表达载体pET28a上，导入大肠杆菌表达菌株BL21中，然后培养并诱导目的基因的表达，亲和层析以纯化重组蛋白。SDS-PAGE电泳、免疫印迹和质谱技术鉴定结果表明，纯化所获得的重组蛋白是Sjγ-CA。利用电极法和分光光度计法分别检测重组的Sjγ-CA在CO2与 \begin{document}${\rm{HCO}}_3^ - $\end{document} 中的水合反应及在乙酸对硝基苯酯水解反应中的活性，结果显示，重组Sjγ-CA的水合酶比活力为0.82 U/mg蛋白，但没有酯酶活性，从而从功能上鉴定了Sjγ-CA。该研究为后续探讨Sjγ-CA在海带配子体乃至孢子体细胞或组织中的亚细胞定位等研究奠定了基础。