Nouvelles approches pour l'analyse cytogenetique des chromosomes humains par l'etude de leur degre de methylation et leur microdissection

Ce travail a pour objectif la mise au point de nouveaux outils destines a la cytogenetique. Nous nous sommes efforces : - d'etablir un nouveau caryotype sur la base de l'etude qualitative et quantitative de la distribution des methylcytosines (mc) du genome humain, - d'etablir un protocole pour la microdissection des chromosomes par le laser, capable de fournir des sondes genomiques avec un delai et un cout raisonnables. Dans le processus tumoral une relation etroite entre la variation du nombre de mc et le caractere malin d'une cellule a deja ete etabli. La possibilite d'analyser cette variation le long des chromosomes metaphasiques de cellules normales ou de lignees leucemiques au moyen d'anticorps, anti-mc (amc) nous a permis de degager les donnees suivantes : - les mc sont reparties le long des chromosomes de cellules normales d'une maniere heterogene produisant un profil de type bande r. Nous avons pu definir avec les amc deux types de bandes r : hautement (rhf) et faiblement (rff) fluorescentes. - sur les chromosomes des cellules provenant de lignees leucemiques, nous avons defini deux autres types de bandes : les rhf + plus fluorescentes que les rhf et les rff 0 qui le sont moins. - il y a une chute du niveau global des mc dans les lignees leucemiques par rapport aux cellules normales. L'analyse fine de plusieurs mc au voisinage des genes mdr1, -globine, l'oncogene c-myc et le gene suppresseur de tumeur p53, montre que ces genes sont differemment methyles dans les cellules normales et issues de lignees leucemiques. Nos conditions experimentales apportent une methode complementaire au banding traditionnel, empruntant une approche structurelle et fonctionnelle. La microdissection des chromosomes pour la preparation de sondes pour l'his est peu employee en raison des infrastructures qu'elle necessite et des difficultes de mise en uvre. Nous avons mis au point un protocole, suffisamment simple qui permet d'obtenir en moins de 24 h. Des fragments d'adn a partir d'une seule copie, de taille variee (300 pb a 4 kb).