Alterações na atividade da iNOS e das ectonucleotidades em astrócitos tratados com meio condicionado e cocultivados com glioma C6

Glioblastoma multiforme, o tumor cerebral primario mais comumente diagnosticado e agressivo em adultos com um periodo de sobrevida medio de 14 meses, e caracterizado por um conjunto de astrocitos neoplasicos pouco diferenciados com alto potencial invasivo e alto grau de angiogenese. Para o desenvolvimento desses tumores nao basta apenas a presenca de celulas tumorais, a existencia de um microambiente favoravel esta relacionada com o aumento de malignidade, a inducao da proliferacao e o desenvolvimento de celulas resistentes a quimioterapia. O aumento da atividade da oxido nitrico sintase induzida (iNOS), que age em termos de angiogenese e desenvolvimento neuronal, bem como alteracoes na sinalizacao purinergica, de forma a aumentar a metabolizacao de nucleotideos extracelulares para levar a um aumento de adenosina cuja atividade imunossupressora e altamente conhecida, tem sido relatadas como fatores que modulam positivamente o microambiente levando ao estabelecimento do tumor. Neste trabalho verificamos a influencia de meio condicionado de glioma C6 (MC-C6) bem como o co-cultivo dessa mesma linhagem celular em cultivos primarios de astrocitos de ratos neonatos, avaliando posteriormente a atividade da enzima iNOS bem como a metabolizacao de ATP, ADP e AMP extracelulares nessas condicoes de cultivo. Astrocitos corticais foram cultivados de acordo com o protocolo descrito por Gottfried (1999), em que ratos de 1-3 dias sao eutanasiados, seus cerebros sao retirados e seus cortices sao isolados, limpos e dissociados, posteriormente as celulas sao semeadas 1,5x105 por poco em uma placa de 24 pocos. Apos a maturacao das celulas, entre 15 e 21 dias, os astrocitos foram tratados com MC-C6 ou submetidos a cocultura com linhagem C6 (10mil celulas por poco) por 24h e 48h, respectivamente. Apos este periodo, o sobrenadante foi coletado para a medicao da atividade da iNOS via reagente de Griess, ja a atividade das ectonucleotidases foi avaliada pelo metodo do verde de malaquita, apos incubacao com nucleotideos (ATP, ADP e AMP) em concentracoes conhecidas (3mM, 3mM e 1mM, respectivamente) por 10 minutos a 37°C. A exposicao de astrocitos, a MC-C6 aumentou em 4,1 vezes a hidrolise de ADP, quando comparados com os controles, astrocitos sozinhos ou C6 sozinha. Do mesmo modo, a hidrolise de ATP e AMP foram aumentadas em 2,43 e 3,24 vezes, respectivamente, em condicoes de cocultivo, quando comparado com os astrocitos ou glioma C6 cultivadas sozinhas. Alem disso, o cocultivo de astrocitos e celulas de glioma C6 induziu um aumento de 15,28 vezes na atividade da iNOS. Os resultados obtidos corroboram com a suposicao do estabelecimento de uma relacao entre o glioma e suas celulas adjacente, astrocitos, atuando em termos de inducao de malignidade via estimulacao da atividade da iNOS bem como inducao de supressao de respostas imunes devido a inducao do acumulo de adenosina pelo metabolismo de nucleotideos extracelulares.