Structural characterization of Ni-containing metalloenzymes from archaea by X-ray crystallography and transmission electron microscopy

In der vorliegenden Arbeit werden zwei Enzymsysteme – Ni-haltige Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (CODH) und [NiFe]-haltige Hydrogenase – strukturell untersucht. Im 1. Teil werden die Untersuchungen des ACDS-Komplexes aus A. fulgidus mittels Transmissionselektronenmikroskopie (Negativkontrastierung und der Kryo-Einbettung) geschildert. Die 3D-Rekonstruktion mit einer Auflosung von 29 A wird de novo ermittelt und drei mogliche Positionen fur die CODH-Untereinheit vorgeschlagen. Im 2. Teil wird die Rontgenkristallstrukturanalyse der CODH-Untereinheit des ACDS Komplexes aus A. fulgidus geschildert. Das Protein besteht aus α- und e-Untereinheiten, die zusammen eine α2e2-Stochiometrie bilden (Afα2e). Wahrend die Gesamtstruktur von Afα2e2 jener von M. barkeri (Mbα2e2) ahnelt, fuhrt der Austausch der koordinierenden Cys zu Asp und Glu zu einer Deletion des verbruckenden FeS-Zentrums. Die Rolle der e-Untereinheit wird durch kinetische Studien untersucht. Die CO-abhangige FAD-Reduktionsaktivitat von Afα2e2 folgt einer Michaelis-Menten Kinetik. Die Mbα2e2 hat ein ahnliches Kinetikverhalten. Im Gegensatz dazu weist die CODH-II von C. hydrogenoformans, die keine e-Untereinheit hat, eine lineare Abhangigkeit der CO-abhangigen FAD-Reduktionsaktivitat von Flavin auf. Diese Beobachtungen sind im Einklang mit der Annahme, dass die e-Untereinheit ein Gerust fur die Flavinbindung bereitstellt. Der 3. Teil ist der F420-reduzierenden Hydrogenase aus M. barkeri (MbFRH) gewidmet. Die Struktur von MbFRH wird mittels Rontgenkristallographie bestimmt und ergibt eine dodekamerische Anordnung von ca. 1.2 MDa. Zusammen mit der etablierten Elektronenubertragungskette, beobachtet in FRH aus M. marburgensis, wird in MbFRH auch ein [2Fe2S]-Cluster und eine Fe-Stelle detektiert. Schlieslich fuhren die schwingungsspektroskopischen Analysen zusammen mit der Rontgenkristallographie zu dem Schluss, dass MbFRH in einem bisher strukturell nicht charakterisierten, katalytisch aktiven Nia-S Zustand isoliert wird.%%%%In this work, we structurally characterize two metal-based enzyme systems from archaea: Ni-containing CO dehydrogenase (CODH) and [NiFe] containing hydrogenase. In the first chapter we investigate, using transmission electron microscopy, the ACDS complex from A. fulgidus (AfACDS). The purified ACDS complex can be visualized as an intact globular protein particle by negative stain and vitrification techniques. The 3D reconstruction is determined de novo to 29 A-resolution by single-particle analysis. We suggest three possible positions for the CODH subunit within ACDS by rigid-body fitting. In the second chapter we determine the X-ray crystal structure of the CODH subunit. The 220 kDa protein is composed of α- and e-subunits that form a heterodimer with (α2e2) stoichiometry (Afα2e2). While the overall structure of Afα2e2 resembles the previously reported structure of the α2e2-subunit from M. barkeri (Mbα2e2), the naturally-occurring exchange of the Cys to Asp and Glu results in a depletion of the bridging iron-sulfur cluster. The role of the…