Vector construction and silencing effect of Edg4 gene targeted small interfering RNA in ovarian cancer cell line

目的 构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA(siRNA)载体,初步观察其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的沉默效应.方法 利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT-U6.1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率.采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸(LPA)含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率.结果 经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT-U6.1-siEdg4.荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64%;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平(0.05±0.01)明显低于转染前(0.29±0.04,P＜0.05);SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为(3.0±1.0)、(7.5±2.2)μmol/L;P＜0.05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前(分别为53.38%、0.51%;P＜0.05).结论 本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。