Bacterial chemoperception during the plant infection process

Las bacterias habitan diversos ecosistemas. Para sobrevivir y adaptarse al entorno, han desarrollado mecanismos de percepcion que les permite monitorizar las condiciones externas e internas. Los sistemas de transduccion son los encargados de unir la percepcion con una respuesta adecuada. La quimiotaxis es un sistema de quimiopercepcion complejo que consiste en la percepcion de gradientes, lo cual desencadena una transduccion de senales que deriva en el control del flagelo y movimiento bacteriano. Los quimiorreceptores son las proteinas implicadas en la percepcion de senales, las cuales son diversas: aminoacidos, poliaminas, acidos organicos, osmolaridad, temperatura y pH, entre otras. Las bacterias fitopatogenas entran en los tejidos de la planta a traves de aperturas naturales, como estomas, o heridas. La quimiotaxis permite la deteccion de los sitios de entrada en estas bacterias, jugando un papel fundamental en las primeras etapas de la infeccion. La informacion respecto a los sistemas de quimiopercepcion de las bacterias fitopatogenas, el perfil de ligando de sus quimiorreceptores y su papel en virulencia es escasa. En esta tesis se ha estudiado el papel de la quimiotaxis en la virulencia de dos bacterias modelo, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (PsPto) y Dickeya dadantii 3937 (Dd3937). PsPto es el agente responsable de la peca bacteriana del tomate y Dd3937 de la podredumbre blanda en patata y otros cultivos. Las enfermedades causadas por estas bacterias tienen un profundo impacto economico. Estas bacterias pueden sobrevivir como epifitas sobre las superficies de la planta y cuando las condiciones son favorables perciben senales de la planta que facilitan su entrada, iniciandose el proceso de infeccion. Para profundizar en el conocimiento sobre los sistemas de quimiopercepcion de estas bacterias, cada cluster de genes de quimiotaxis ha sido asignado a un sistema especifico. Del mismo modo, atendiendo a los datos disponibles y a su estructura, se ha propuesto la asignacion de los quimiorreceptores a vias de quimiopercepcion concretas. El quimiorreceptor PsPto-PscA de PsPto fue caracterizado en base a su similitud de secuencia con el quimiorreceptor PscA de P. syringae pv. actinidae, el cual se une a D/L-Aspartico y L-Glutamico. Estos L-aminoacidos son los mas abundantes en el apoplasto de tomate. Como se preveia, PsPto-PscA se une a los tres ligandos de PscA. La percepcion de estos ligandos juega un papel en el swarming bacteriano, formacion de biofilm y la regulacion de los niveles del segundo mensajero c-di-GMP. La cepa mutada en este quimiorreceptor presenta una menor virulencia en tomate. Ademas, la saturacion de este quimiorreceptor con D-Asp redujo la virulencia bacteriana en tres ordenes de magnitud, pudiendo ser un candidato para el diseno de estrategias de proteccion de cultivos. El quimiorreceptor ABF-20167 de Dd3937 fue caracterizado por su posible papel en la percepcion de la hormona vegetal acido jasmonico (JA por sus siglas en ingles). Esta hormona es producida por la planta en respuesta a heridas, desencadenando una repuesta de defensa. Los ensayos de quimiotaxis realizados muestran que ABF-20167 esta implicado en la quimioatraccion hacia JA y coronatina, una toxina bacteriana con una estructura similar a JA que se une a los mismos receptores en la planta. Los ensayos de entrada en plantas silvestres muestran que la cepa mutante en este quimiorreceptor presenta una menor entrada. Sin embargo, la entrada es similar a la de la cepa silvestre en lineas transgenicas de estas plantas que producen menos JA en respuesta a heridas. Los ensayos de union a ligando descartan un reconocimiento directo de JA y coronatina por parte del quimiorreceptor y los analisis de expresion genica muestran que la presencia de JA regula la expresion de genes implicados en quimiotaxis, resistencia a estres y virulencia. En resumen, este trabajo ha contribuido a incrementar la informacion sobre los sistemas de quimiopercepcion de estas dos bacterias y al estudio del mecanismo de percepcion de 2 quimioreceptores, cuya funcion esta relacionada con el control de la virulencia. ----------ABSTRACT---------- Bacteria are ubiquitous, inhabiting a wide variety of ecosystems. In order to survive and adapt to the environment, they have evolved perception mechanisms to monitor external and internal conditions. Signal transduction systems link bacterial perception to a proper bacterial response. Chemotaxis is a complex chemosensory system that consist on the perception of signal gradients, which triggers a signal transduction that derives in the control of the flagellar motor and bacterial movement. Chemoreceptors are the proteins involved in signal perception. Signals perceived are diverse, including amino acids, polyamines, organic acids, changes in osmolarity, temperature and pH, among others. Phytopathogenic bacteria enter the plant tissues through natural openings, like stomata, and wounds. Chemotaxis enables the detection of entry sites in these bacteria, playing a key role in the early stages of infection. Information regarding the chemosensory systems of phytopathogenic bacteria is scarce, as well as the ligand profile of their chemoreceptors and the role of the signals perceived in bacterial virulence. In this thesis, we have studied the role of chemotaxis in virulence of two model bacteria, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (PsPto) and Dickeya dadantii 3937 (Dd3937). PsPto is the causal agent of bacterial speck in tomato and Dd3937 the causal agent of soft rot in potato and other crops. The diseases caused by these two bacteria produce an important economic impact. These bacteria can survive as epiphytes on the plant surfaces and when conditions are favorable, perception of signals derived from the plant enables their entry into the plant, starting the infection process. To gain insight into the chemosensory systems of these bacteria, each chemotaxis gene cluster has been assigned to a specific system. Considering available data, the assignment of chemoreceptors to specific chemosensory systems has been proposed. Chemoreceptor PsPto-PscA of PsPto was characterized based on sequence similarity with chemoreceptor PscA of P. syringae pv. actinidae, which binds D/L-Aspartic and L-Glutamic. These L-amino acids are the most abundant amino acids in tomato apoplast. As expected, PsPto-PscA binds these three ligands. Interestingly, this perception also influences bacterial swarming, biofilm formation and is involved in the regulation of the levels of the second messenger c-di-GMP. Mutant strain of this receptor presents an impaired virulence to tomato. In addition, when this chemoreceptor was saturated with D-Asp, bacterial virulence was reduced in three orders of magnitude, suggesting D-Asp could be used as part of an interference strategy to protect crops. Chemoreceptor ABF-20167 of Dd3937 was characterized based on previous data that showed a possible role in the perception of the plant hormone jasmonic acid (JA). This hormone is produced by the plant in response to wounds, triggering a defensive response. Chemotaxis assays show ABF-20167 is involved in the chemoattraction towards JA and coronatine, a bacterial toxin with a similar structure to JA that binds to the plant receptor of JA. Entry assays in hosts of Dd3937 show a reduced entry of the mutant strain. However, this differential entry between strains was abolished in transgenic lines of these plants that present a diminished production of JA in response to wounds. Ligand binding assays performed discard a direct recognition of JA by the chemoreceptor and the analysis of gene expression shows this phytohormone regulates the expression of genes involved in chemotaxis, stressful conditions response and virulence. Overall, this research work has contributed to increase the knowledge regarding the chemosensory systems of these two bacteria and to the analysis of the perception mechanism of 2 chemoreceptors involved in virulence control in PsPto and Dd3937.