Aplicación de las técnicas de secuenciación masiva al estudio de la infección por Helicobacter Pylori

INTRODUCCION Las tecnicas de secuenciacion han evolucionado con rapidez desde su desarrollo en la decada de 1970. Actualmente, las tecnicas de secuenciacion masiva permiten obtener millones de secuencias en poco tiempo, lo que ha permitido secuenciar genomas completos (eucariotas y procariotas) y tambien estudiar el microbioma humano. El objetivo de este trabajo es explorar la aplicabilidad que las tecnicas de secuenciacion masiva pueden tener en el estudio de la infeccion por Helicobacter pylori, un bacilo Gram negativo microaerofilico que coloniza la mucosa gastrica humana pudiendo generar patologias como la gastritis, ulcera peptica, carcinoma gastrico y linfoma tipo MALT. El trabajo se estructura en una primera seccion de secuenciacion de 20 genomas de H. pylori con el estudio de los factores de virulencia, el tipado in silico de las cepas mediante estudio de MLST y estudio del pan-genoma y una segunda seccion de estudio del microbioma gastrico, comparando los resultados de dos tecnicas de secuenciacion masiva (454 de Roche y MiSeq de Illumina) en pacientes colonizados y no colonizados por H. pylori, asi como una aproximacion a la actividad transcripcional de los microorganismos detectados. MATERIALES Y METODOS Se incluyeron en el estudio 39 pacientes pediatricos a los que se realizo endoscopia digestiva para toma de biopsia de antro gastrico. De ellos, 28 fueron H. pylori positivos (cultivo de H. pylori a partir de biospia positivo): 18 se incluyeron en el estudio de genomas, 8 en el de microbioma y 2 en ambos. Los 11 restantes fueron H. pylori negativos (cultivo negativo de H. pylori a partir de biospia y prueba de ureasa rapida negativa): todos ellos incluidos en el estudio del microbioma. Para cada cepa incluida en el estudio de genomas se realizo secuenciacion de alto rendimiento del genoma completo mediante el equipo MiSeq (Illumina). Para las biopsias incluidas en el estudio del microbioma se realizo estudio de la densidad bacteriana mediante qPCR del 16S y estudio del microbioma de forma paralela mediante secuenciacion del gen ARNr 16S por tecnologia MiSeq (Illumina) y 454 (Roche). El estudio de la actividad transcripcional se realizo unicamente mediante tecnologia MiSeq (Illumina). El analisis de resultados de los genomas secuenciados se realizo utilizando las herramientas informaticas PROKKA v1.12, virtual MLST 2.0, build_PGAdb, build_wgMLSTtree e iTOL. Los analisis de microbioma gastrico se llevaron a cabo utilizando la plataforma QIIME v1.8.0 y SPSS 15.0. RESULTADOS Mediante el analisis de los genomas completos se comprobo que la mayoria de cepas estudiadas presentan perfiles poco virulentos (4 de las 20 cepas eran cagA positivas con motivos EPIYA tipo ABC y -BC y 5 de las 20 cepas presentaron el alelo s1 de vacA). Tambien se objetivo que el tipado mediante MLST no es util en el caso de H. pylori y que el estudio del pan-genoma y mas concretamente del genoma core permite apreciar relaciones filogeneticas de forma mas precisa. En el estudio del microbioma gastrico, se observo que la densidad bacteriana en las biopsias varia entre los pacientes H. pylori negativos y positivos, siendo mayor en los positivos. El estudio mediante secuenciacion masiva puso de manifiesto diferencias entre las dos tecnicas utilizadas, principalmente a nivel de alfa diversidad, ya que se obtuvieron diferencias estadisticamente significativas en el indice de Shannon entre los pacientes H. pylori negativos y positivos al trabajar con tecnologia MiSeq, pero no con 454. En cuanto a la beta diversidad, se observaron diferencias estadisticamente significativas al analizar los resultados obtenidos mediante la tecnologia MiSeq y 454 en funcion del resultado del cultivo tanto en el analisis cualitativo como cuantitativo. Al realizar el analisis en funcion de los hallazgos histologicos, se obtuvieron diferencias estadisticamente significativas (en el analisis cualitativo y cuantitativo) unicamente mediante tecnologia MiSeq. En el analisis taxonomico a nivel de filo se observo una diferencia en el grupo H. pylori negativo en la abundacia relativa de los filos Proteobacteria (el mas abundante por tecnologia MiSeq) y Firmicutes (el mas abudante por tecnologia 454), pero no se observo en el grupo de H. pylori positivos. A nivel de genero, los resultados en el grupo H. pylori positivos fueron similares, pero en el grupo H. pylori negativos, se observaron abundancias relativas entre el 2 y el 9% por tecnologia MiSeq en generos que apenas tuvieron representacion por tecnologia 454. En cuanto al analisis de actividad transcripcional, los generos Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Veillonella y Prevotella, se encontraron mas activos en las muestras provenientes de pacientes H. pylori positivos, mientras que el genero Helicobacter aparecio mas activo en las muestras de pacientes H. pylori negativos. CONCLUSIONES El anaisis de genomas completos permite concluir que las cepas que circulan en nuestro entorno son, en general, poco virulentas, que el genoma core de H. pylori comprende un bajo porcentaje del total de genes presentes en su cromosoma y disminuye al incorporar cepas de diversos origenes geograficos. Ademas, las cepas de H. pylori son geneticamente diversas y no presentan, en general, relaciones filogeneticas entre ellas. En cuanto al estudio de las biopsias gastricas, se ha podido comprobar que la densidad bacteriana analizada mediante qPCR es diferente entre pacientes H. pylori positivos y H. pylori negativos. El microbioma gastrico presenta diferencias entre H. pylori positivos y negativos en cuanto a alfa-diversidad mediante tecnologia MiSeq. En cuanto a beta diversidad, existen diferencias entre pacientes H. pylori positivos y H. pylori negativos tanto en el analisis por 454 como por MiSeq y mientras que solamente se observan diferencias en funcion de los hallazgos histologicos en el analisis mediante MiSeq. El estudio taxonomico revela un predominio de los filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria en los pacientes H. pylori positivos y negativos. Helicobacter es el genero predominante en las muestras de pacientes H. pyori positivos y Streptococcus en los pacientes H. pylori negativos, independientemente de la plataforma de secuenciacion utilizada. El uso de diferentes protocolos de secuenciacion implica diferencias en los resultados, fundamentalmente a nivel de alfa diversidad y analisis de la composicion taxonomica. Es posible detectar secuencias de ARN bacteriano en biopsias gastricas de pacientes con y sin infeccion por H. pylori que orientan a pensar en una comunidad bacteriana estable y activa en el estomago.