荷包猪SLA-2-HB01真核表达载体的构建及在PK15细胞中的表达

为构建荷包猪SLA-2-HB01真核细胞表达载体，观察其在PK15细胞中的表达情况。首先参考SLA-2-HB01基因编码区序列设计了引物对，以SLA-2-HB01-pMD 18-T为模板PCR扩增获得SLA-2-HB01编码区基因片段，经TA克隆及菌落PCR筛选得到阳性克隆菌。测序正确后大量双酶切回收目的基因片段并与真核表达载体pEGFP N3相连接获得重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3，重组质粒转化至大肠杆菌经大量克隆后，抽提阳性重组质粒并通过脂质体介导转染至PK15细胞，通过荧光显微镜观察转染后PK15细胞的荧光强度，进一步通过Western Blotting检测PK15细胞中SLA-2-HB01蛋白的表达情况。结果显示PCR成功扩增得到SLA-2-HB01，大小为1 104 bp，并成功构建重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3，酶切鉴定证实插入片段大小为1 092 bp。SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒转染PK15细胞后具有绿色荧光，Western Blotting显示SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白分子量大小为70 kD，与理论值相符。成功构建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒，并初步确认SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白成功在PK15细胞中表达，为下一步进行SLA-2-HB01递呈多肽表位的研究奠定基础。