Etudes structurales et fonctionnelles de l'IRES du VHC en association avec le motif de reconnaissance à l'ARN de la sous-unité b du facteur eIF3

L'IRES du VHC est organise en une structure secondaire, complexe et hautement conservee, qui comprend quatre domaines distincts (I-IV). Cette organisation permet la liaison directe du facteur d'initiation eucaryote eIF3 et de la sous-unite 40S du ribosome. Le facteur d'initiation eucaryote eIF3 est un complexe de 13 proteines (~ 800 kDa). Certaines de ses sous-unites montrent une affinite pour l'ARN, et parmi elles deux possedent des motifs de reconnaissance a l'ARN (MRR) : eIF3b (aa : 185-268) et eIF3g (aa : 239-317). Afin de determiner l'implication de ces motifs dans l'interaction ARN-proteine, nous avons clone les domaines contenant ces motifs MRR, ainsi que les proteines entieres eIF3b et eIF3g. Nous avons ensuite etudie l'interaction de l'ARN et/ou domaines d'ARN avec le complexe eIF3 et/ou proteines ou domaines proteiques en utilisant la methode de retention sur filtre. Nous avons ainsi calcule les differentes constantes apparentes de dissociation entre : eIF3/IRES, eIF3b/IRES et MRR-eIF3b/IRES. Ces resultats montrent que la sous-unite eIF3b se lie directement au domaine III de l'IRES via son motif MRR situe dans le domaine N-terminal. Dans un deuxieme temps, nous avons utilise la spectroscopie RMN pour identifier precisement les acides amines impliques dans la reconnaissance de l'ARN viral. En utilisant differentes techniques telles que FBA, RMN et SAXS, il s'avere que le domaine IIId (30 nucleotides) represente le motif minimum implique dans l'interaction MRR-eIF3b/IRES. Enfin, la technique de SAXS a ete mise a profit pour etudier la structure tridimensionnelle de l'IRES libre en solution.