Metabolic engineering and genome editing in rice

El meu programa d’investigacio s’ha basat en la utilitzacio de l’arros com a model experimental per a estudiar mecanismes i colls d’ampolla que limiten la transicio de l’enginyeria metabolica a la biologia sintetica en les plantes. Em vaig concentrar en la caracteritzacio a nivell molecular i bioquimica de plantes que vaig generar en dos conjunts de linies d’investigacio diferents pero interrelacionades. En el primer conjunt d’experiments vaig abordar la hipotesi que en eliminar gens especifics en una ruta metabolica primaria, concretament la biosintesi de mido, les plantes mutants resultants podrien mostrar fenotips propicis per a aplicacions de biologia sintetica en termes de redireccionar el flux i limitar els precursors biosintetics a vies metaboliques secundaries especifiques. En aquest context, vaig utilitzar CRISPR/Cas9 per crear dos mutants heterozigots, un amb una glucosa-1-fosfat adenil transferasa (AGPasa) citosolica severament truncada i no funcional i l’altre amb una modificacio estructural C-terminal causant una perdua parcial d’activitat. Inesperadament, vaig observar una reduccio del mido en les fulles de tots dos mutants i un augment concomitant en el nivell de sucres solubles. Aixo es va reflectir en l’expressio no prevista d'OsAPL2 i OsAPS2b en les fulles, generant una AGPasa ectopica completa en el citosol de la fulla, i una disminucio en l’expressio de la subunitat petita plastidial OsAPS2a que es va complementar nomes parcialment amb un augment en l’expressio de OsAPS1 En un conjunt posterior d’experiments amb base similar, vaig investigar els efectes mes amplis de les mutacions en un gen de la biosintesi de mido, la mido sintasa unida a granuls (GBBS, waxy). Vaig utilitzar CRISPR / Cas9 per introduir un rang de mutacions amb diferents efectes en aquest gen especific. Vaig trobar que les mutacions produides van reduir, pero no van abolir totalment, l’activitat de GBSS en les llavors a causa d’una compensacio parcial causada per la regulacio ectopica de GBSSII. L’activitat de GBSS en els mutants va ser de 61 a 71% dels nivells dels controls, pero el contingut d'amilosa, va disminuir del 8 al 12% en llavors heterozigotes i va ser tan baix com nomes un 5% en llavors homozigotes, acompanyat per una organitzacio cel•lular anormal en la capa d'aleurona i amb estructures del gra de mido amorfes. Gairebe tots els gens de la via del mido es van veure afectats a diferents nivells en les fulles i llavors. Aquests canvis en l’expressio genica van donar com a resultat canvis en l’activitat de la AGPasa i de la sacarosa sintasa que coincidien amb els nivells corresponents de mido i sucres solubles. La segona linia del meu programa d’investigacio es va centrar en l’enginyeria d'una via ectopica de MVA en plastidis d’arros per investigar la hipotesi que al reconstituir la via ectopica, la regulacio estricta de la via de MVA nativa podria relaxar-se en cert grau a mesura que augmentes el conjunt de precursors terpenoides essencials. Els resultats van indicar un augment molt elevat dels nivells d’acids grassos, luteina i tocoferol, i una reduccio en els nivells d'esquale i d’esterols. Els meus resultats son el fonament per a futurs experiments encaminats a determinar si el germoplasma que he creat i caracteritzat pot servir de base per a intervencions d’enginyeria metabolica i biologia sintetica mes complexes. Mi programa de investigacion se ha basado en la utilizacion del arroz como modelo experimental para estudiar mecanismos y cuellos de botella que limitan la transicion de la ingenieria metabolica a la biologia sintetica en las plantas. Me concentre en la caracterizacion a nivel molecular y bioquimica de plantas que genere en dos conjuntos de lineas de investigacion distintas pero interrelacionadas. En el primer conjunto de experimentos aborde la hipotesis de que al eliminar genes especificos en una ruta metabolica primaria, concretamente la biosintesis de almidon, las plantas mutantes resultantes podrian mostrar fenotipos propicios para aplicaciones de biologia sintetica en terminos de redireccionar el flujo y limitar los precursores biosinteticos a vias metabolicas secundarias especificas. En este contexto, utilice CRISPR/Cas9 para crear dos mutantes heterocigotos, uno con una glucosa-1-fosfato adenil transferasa (AGPasa) citosolica severamente truncada y no funcional y el otro con una modificacion estructural C-terminal causando una perdida parcial de actividad. Inesperadamente, observamos una reduccion del almidon en las hojas de ambos mutantes y un aumento concomitante en el nivel de azucares solubles. Esto reflejo la expresion no prevista de OsAPL2 y OsAPS2b en las hojas, generando una AGPasa ectopica completa en el citosol de la hoja, y una disminucion en la expresion de la subunidad pequena plastidial OsAPS2a que se complemento solo parcialmente con un aumento en la expresion de OsAPS1 En un conjunto posterior de experimentos, con similar base, investigue los efectos mas amplios de las mutaciones en un gen de la biosintesis de almidon, la almidon sintasa unida a granulos (GBBS, waxy). Utilice CRISPR/Cas9 para introducir un rango de mutaciones con diferentes efectos en este gen especifico. Encontre que las mutaciones producidas redujeron, pero no abolieron la actividad de GBSS en las semillas, debido a una compensacion parcial causada por la regulacion ectopica de GBSSII. La actividad de GBSS en los mutantes fue de 61 a 71% de los niveles de los controles, pero el contenido de amilosa, sin embargo, disminuyo a 8 a 12% en semillas heterocigotas y fue tan bajo como 5% en semillas homocigotas, acompanado por una organizacion celular anormal en la capa de aleurona y con estructuras del grano de almidon amorfas. Casi todos los genes de la via del almidon se vieron afectados a diferentes niveles en las hojas y semillas. Estos cambios en la expresion genica dieron como resultado cambios en la actividad de la AGPasa y de la sacarosa sintasa que coincidian con las alteraciones en los niveles de almidon y azucares solubles. La segunda linea de mi programa de investigacion se centro en la ingenieria de una via ectopica de MVA en plastidios de arroz para investigar la hipotesis de que al reconstituir la via ectopica, la regulacion estricta de la via de MVA nativa podria relajarse en cierto grado a medida que aumentase el conjunto de precursores terpenoides esenciales. Los resultados indicaron un aumento en los niveles de acidos grasos, luteina y tocoferol, una reduccion en los niveles de escualeno y niveles similares de esteroles. Mis resultados son el fundamento para futuros experimentos encaminados a determinar si el germoplasma que he creado y caracterizado puede servir de base para intervenciones de ingenieria metabolica y biologia sintetica mas complejas. My research program used rice as an experimental model to address fundamental bottlenecks and mechanisms limiting the transition from metabolic engineering to synthetic biology in plants. I concentrated on an in depth molecular and biochemical characterization of plants I generated in two distinct, yet interrelated sets of research lines. In the first set of experiments I addressed the hypothesis that by knocking out specific genes in a primary metabolic pathway, starch biosynthesis, resulting mutant plants might exhibit phenotypes conducive to synthetic biology applications in terms of redirecting flux and limiting biosynthetic precursors to specific secondary metabolic pathways. In this context I used CRISPR/Cas9 to create two heterozygous mutants, one with a severely truncated and non-functional cytosolic glucose-1-phosphate adenylyl transferase (AGPase) and the other with a C-terminal structural modification causing a partial loss of activity. Unexpectedly, both mutants exhibited depletion of starch in the leaves and a corresponding increase in the level of soluble sugars. This reflected the unanticipated expression of both OsAPL2 and OsAPS2b in the leaves, generating a complete ectopic AGPase in the leaf cytosol, and a corresponding decrease in the expression of the plastidial small subunit OsAPS2a that was only partially complemented by an increase in the expression of OsAPS1. In a subsequent set of experiments along similar lines I investigated the broader effects of mutations in an additional starch biosynthetic gene, granule bound starch synthase (GBBS, waxy). I used CRISPR/Cas9 to introduce a range of mutations with different effects in this specific gene. All mutations I recovered reduced but did not abolish GBSS activity in seeds due to partial compensation caused by the ectopic upregulation of GBSSII. The GBSS activity in the mutants was 61–71% of wild-type levels, but the amylose content nevertheless declined to 8–12% in heterozygous seeds and to as low as 5% in homozygous seeds, accompanied by abnormal cellular organization in the aleurone layer and amorphous starch grain structures. Almost every starch pathway gene was impacted at different degrees in leaves and seeds. These gene expression changes resulted in changes in AGPase and sucrose synthase activity that explained the corresponding levels of starch and soluble sugars. The second line of my program focused on the engineering of an ectopic MVA pathway in rice plastids in order to investigate the hypothesis that by reconstituting such an ectopic pathway the strict regulation of the native MVA pathway might be relieved to a certain degree in turns increasing the pool of essential terpenoid precursors. Results indicated a profound increase in the levels of fatty acids, lutein and tocopherol, a decrease in squalene levels and similar levels of sterols. My results set the stage for further experiments to ascertain whether germplasm I created and characterized, can serve as a basis for more complex metabolic engineering and synthetic biology interventions.