Etude de la régulation du VDAC des mitochondries de Phaseolus coccineus par les lipides membranaires

Chez les vegetaux, peu de canaux ioniques sont identifies moleculairement. Nos travaux, par l’apport de preuves fonctionnelles, mettent en evidence les proprietes electrophysiologiques d’une proteine de la membrane mitochondriale externe (MOM) de Phaseolus coccineus, VDAC32. Nous montrons que cette proteine forme un canal partageant plusieurs caracteristiques electrophysiologiques typiques des canaux anioniques voltages dependants (VDACs) (cinetique d'ouverture et de fermeture, sensibilite au voltage, conductance relativement grande, courbe de voltage dependance en forme de cloche). Nous avons constate que la concentration saline avait un effet sur la voltage-dependance du canal. En effet, le VDAC devient insensible a la difference de potentiel appliquee lorsqu'il est reconstitue dans des concentrations physiologiques en sel. Nombreuses sont les experiences realisees dans des conditions non physiologiques (1 M KCl), mais nous montrons dans ce travail que le canal ne se comporte pas de la meme maniere en conditions physiologiques (0,1 M KCl).La premiere partie de notre travail a ete consacree a l’etude de l’effet du cholesterol et deux phytosterols les plus abondants (sitosterol et stigmasterol) sur la voltage-dependance du VDAC. Dans ce chapitre, nous avons montre l’effet des sterols sur la fonction des canaux ioniques au niveau moleculaire. Le role des sterols sur la selectivite et la voltage-dependance du VDAC a ete mis en evidence. L’etude des phytosterols a permis de comprendre comment les proprietes du VDAC peuvent etre modulees avec le type de sterol et son abondance dans la membrane. De meme, la reversibilite de l’effet des phytosterols sur le VDAC en presence de la Methyle-β-cyclodextrine a ete prouvee. La conductance unitaire n’etait pas affectee par l’addition des sterols.Le deuxieme chapitre de cette these a ete consacre a l’etude des deux principaux phospholipides membranaires ; la phosphatidylcholine (PC) et phosphatidyl-ethalamine (PE). Il a ete montre qu’a des concentrations salines similaires a celles trouvees in vivo, la voltage-dependance du VDAC est inhibee en presence de membrane formee de PC mais pas en presence de membrane formee de PE et/ou PE methyle une fois et deux fois. De meme, la voltage-dependance est restauree suite a l’ajout de 2% de phytosterol ou de 2% de PE ou lorsque le degre de methylation de la choline diminue. L’effet des sterols sur la voltage-dependance est reversible. Nous avons montre que la selectivite aux anions augment lorsque le degre de methylation de la choline diminue tandis que la conductance unitaire du canal est invariable.Nos resultats indiquent que l’interaction lipide-proteine est essentielle pour la regulation de l’activite du canal VDAC. La nature de la tete polaire des lipides est determinante pour cette regulation ce qui suggere qu’elle s’effectue au niveau de l’interface membrane-solution. La suite de nos travaux nous a conduit a l’etude de l’effet du cation monovalent, divalent et trivalent sur le VDAC. Nous avons montre que la voltage-dependance est perdue dans des concentrations faibles en KCl (100 mM) et que cette derniere est restauree en presence de 800 mmolale en KCl ou 100 mM de calcium ou 30 mM de lanthane. Ces resultats suggerent que la restauration de la voltage-dependance a des faibles concentrations en sel (100 mmolale) impliquerait un effet electrostatique/In plants, only some ion channels are identified molecularly. By providing functional evidence, our work highlights electrophysiological properties of the outer mitochondrial membrane (MOM) protein of Phaseolus coccineus, VDAC32. We show that this protein forms a channel sharing several typical electrophysiological characteristics of voltages dependent anion channels (VDACs) (gating kinetics, voltage sensitivity, relatively large conductance, voltage dependence curve bell-shaped).We found that the salt concentration had an effect on the voltage-dependence of channel. Indeed, VDAC becomes insensitive to the applied potential difference when it was reconstituted in physiological salt concentrations. The greater part of the experiments were performed under non-physiological conditions (1 M KCl), but we show in our work that the channel does not have the same behavior under physiological conditions (0.1 M KCl).The first part of our work has been devoted to the study of the effect of cholesterol and the two most abundant phytosterols (sitosterol and stigmasterol) on the VDAC voltage dependence. In this chapter, we have shown the effect of sterols on ion channel function at the molecular level. The role of sterols on the selectivity and the voltage-dependence of VDAC was highlighted. The study of phytosterols helped us to understand how the properties of VDAC can be modulated with the type of sterol and its abundance in the membrane. Similarly, the reversibility of the effect of phytosterols on the VDAC in the presence of Methyl-β-cyclodextrin has been proven. The unit conductance was not affected by the addition of sterols.The second chapter of this thesis was devoted to the study of the two major membrane phospholipids, phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethalamine (PE). It has been shown that in similar salt concentrations to those found in vivo, the VDAC voltage-dependence is inhibited in the presence of membrane formed by PC but not in the presence of membrane formed by PE and/or PE methylated once and two times. Similarly, the voltage-dependence is recovered following the addition of 2% of phytosterol or 2% of PE or when the degree of methylation of choline decreases. The effect of sterols on the voltage-dependence is reversible. We have shown that the anion selectivity increases when the degree of methylation of choline decreases while the unitary conductance of the channel is invariable.Our results indicate that lipid-protein interaction is essential for the regulation of the activity of VDAC channel. The nature of the lipids polar head is crucial for this regulation suggesting that it occurs at the membrane-solution interface.The rest of our work has led us to study the effect of monovalent, divalent and trivalent cation on VDAC. We have shown that the voltage-dependence is lost in low concentrations of KCl (100 mM) and it is restored in the presence of 800 mmolale of KCl or 100 mM of calcium or 30 mM of lanthanum. These results suggest that the restoration of the voltage-dependence at low salt concentrations (100 mmolale) involve an electrostatic effect.