Entschlüsselung der Biosynthese und des Transports von α-Glucanen bei Mycobacterium tuberculosis

Tuberkulose (TB) ist eine der weltweit haufigsten Todesursachen, die durch einen einzigen infektiosen Organismus, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), verursacht wird und von dem jedes Jahr Millionen Menschen betroffen sind. Es gab keine anderen Stauseen fur Mtb auser Menschen. Daher hat sich dieser Erreger weiterentwickelt und sein Stoffwechsel- und Virulenzsystem angepasst, um in menschlichen Makrophagen zu wachsen und sich zu vermehren. Die einzigartige Zellhulle von Mtb besteht aus verschiedenen Glykokonjugaten, die entweder wesentliche Strukturkomponenten oder Virulenzdeterminanten sind. Mtb produziert auch intrazellulare Glykokonjugate wie Trehalose- und Methylglucoselipopolysaccharide (MGLP), die entscheidend an der Lebensfahigkeit und Virulenz des Bazillus beteiligt sind. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf die Charakterisierung des Metabolismus, der Biosynthese und des Transports von Trehalose und MGLP in Mtb. In Kapitel 3 wurde der Transport von Trehalose durch die ausere Mykolsaure enthaltende Mycomembran untersucht. Es wurde zuvor gezeigt, dass der ABC-Transporter LpqY-SugA-SugB-SugC die spezifische Aufnahme von Trehalose uber die cytoplasmatische Membran vermittelt. Es war jedoch nicht bekannt, wie der Transport von Trehalose durch die Mycomembran vermittelt wird. In dieser Studie wurde die antimykobakterielle Aktivitat von 6-Azido-Trehalose genutzt, um spontan resistente Mtb-Mutanten in einem merodiploiden Stamm auszuwahlen, der zwei LpqY-SugA-SugB-SugC-Kopien enthalt. Mutationen, die Resistenz gegen 6-Azido-Trehalose vermitteln, sind auf das Mitglied der Prolin-Prolin-Glutamat (PPE) -Familie PPE51 (Rv3136) abgebildet, von dem kurzlich gezeigt wurde, dass es ein integrales Mycomembranprotein ist, das an der Aufnahme mehrerer niedermolekularer Verbindungen, einschlieslich einiger Mono, beteiligt ist - und Disaccharide. Eine ortsspezifische ppe51-Gendeletionsmutante von Mtb konnte nicht auf Trehalose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Daruber hinaus bestatigte die bioorthogonale Markierung von Zellen der mit 6-Azido-Trehalose inkubierten Mtb-Δppe51-Mutante die beeintrachtigte Internalisierung. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass der Transport von Trehalose und Trehalose-Analoga durch die Mycomembran von Mtb ausschlieslich durch PPE51 vermittelt wird. Mtb produziert auch oligomere Glykokonjugate des cytoplasmatischen Komplexes wie 6-O-Methylglucose-Lipopolysaccharide (MGLP), die in vitro mit Fettacylketten und Acyl-CoA einen stabilen Komplex im Verhaltnis 1: 1 bilden konnen. Dabei wurde MGLP vorgeschlagen, um die enzymatische Aktivitat der Fettsauresynthase I zu regulieren. Bisher konnte die biologische Funktion von MGLP jedoch aufgrund des Fehlens von Mtb-Mutantenstammen, die eine wesentliche Verringerung der MGLP-Bildung zeigen, nie validiert werden. MGLP umfasst 10-20 Glucose- oder 6-O-Methylglucose-Einheiten mit zusatzlichen 3-O-Methylglucose-Einheiten am nicht reduzierenden Ende und Diglucosylglycerat (DGG) als Startereinheit am reduzierenden Ende. Die Bildung von DGG aus Glucosylglycerat ist ein wesentlicher Schritt bei der Synthese von MGLP. In Kapitel 4 nehmen wir an, dass das Enzym, das die DGG-Bildung katalysiert, ein Verzweigungsenzym ist, das vom essentiellen Rv3031-Gen kodiert wird. Eine bedingte Rv3031-Mutante wurde in Mtb H37Rv durch Insertion einer Tetracyclin-regulierbaren synthetischen Promotor-Kassette unmittelbar vor dem Startcodon von Rv3031 unter Verwendung einer speziellen Transduktion erzeugt. Wir haben die Wesentlichkeit des Gens durch bedingte Stummschaltung validiert. Wir fuhrten eine proteomische Profilierung der bedingten Mutante sowohl unter vollstandig induzierten als auch unter teilweise stillgelegten Bedingungen durch, um unterschiedliche Expressionsniveaus von Proteinen zu beobachten, die mit der Mykolsaurebiosynthese und Mycomembranproteinen zusammenhangen. Mykolsauremethylester wurden extrahiert, um den Mykolsauregehalt bei verschiedenen Genexpressionsniveaus von Rv3031 zu uberwachen. Zusammengenommen liefern die Ergebnisse die Grundlage fur das Verstandnis der Rolle des mutmaslichen Verzweigungsenzyms Rv3031 bei der MGLP-Biosynthese in Mtb. Schlechte Diagnosewerkzeuge zur Erkennung aktiver Krankheiten begrenzen Tuberkulose-Bekampfungsprogramme und beeintrachtigen die Patientenversorgung. Eine genaue Erkennung von lebendem Mtb konnte die Tuberkulose-Diagnose und die Behandlung des Patienten verbessern. In Kapitel 5 berichten wir, dass Mykobakterien und andere Corynebakterien mit einem fluorogenen Trehaloseanalogon spezifisch nachgewiesen werden konnen. Wir haben eine 4-N, N-Dimethylamino-1,8-naphthalimid-konjugierte Trehalose (DMN-Tre) -Sonde entwickelt, die beim Ubergang von wassriger zu hydrophober Umgebung eine> 700-fache Zunahme der Fluoreszenzintensitat erfahrt. Diese Verbesserung tritt bei der metabolischen Umwandlung von DMN-Tre in Trehalosemonomykolat und beim Einbau von Actinobakterien in die Mycomembran auf. Die DMN-Tre-Markierung ermoglichte die schnelle Visualisierung von mykobakteriellen und corynebakteriellen Spezies ohne Waschen ohne unspezifische Markierung von grampositiven oder gramnegativen Bakterien. Die DMN-Tre-Markierung wurde innerhalb von Minuten nachgewiesen und durch Hitzetotung von Mykobakterien gehemmt. Daruber hinaus wurde die DMN-Tre-Markierung im Gegensatz zur klinisch verwendeten Auramin-Farbung durch Behandlung mit TB-Arzneimitteln reduziert. Schlieslich ist die DMN-Tre-Markierung eine betrieblich einfache Methode, die zur schnellen Diagnose von Tuberkulose eingesetzt werden kann.