Régulation de l'expression des connexines dans la différenciation de l'épithélium épididymaire

L’epididyme est l’organe responsable de la maturation des spermatozoides, son role est essentiel dans l’acquisition de la fertilite masculine. Ce processus crucial est dependant des interactions entre les spermatozoides et le microenvironnement luminal de l’epididyme. La composition de ce microenvironnement specifique est regulee par les differents types cellulaires presents au sein de l’epithelium de l’epididyme et evolue tout au long de cet organe. Afin de synchroniser leurs actions, les cellules epitheliales communiquent entre elles par l’intermediaire des jonctions lacunaires. Les jonctions lacunaires sont composees de canaux transmembranaires entre deux cellules adjacentes, ce qui leur permet de communiquer par la diffusion directe d’ions et de petites molecules. Les connexines (Cxs) sont les proteines qui composent ces canaux transmembranaires. Dans l’epididyme du rat, Gjb5 (Cx30.3), Gjb4 (Cx31.1), Gjb1 (Cx32) et Gja1 (Cx43) sont presentes au sein de l’epithelium adulte differencie alors que Gjb2 (Cx26) est uniquement detectable chez les jeunes animaux, lorsque l’epithelium est indifferencie. Ces changements d’expression des Cxs modifient la selectivite des jonctions lacunaires et permettent aux cellules de l’epithelium de modifier leurs echanges. On observe un changement de l’expression des Cxs pendant la differenciation du tissu, ce qui suggere un role cle des Cxs dans la regulation de la differentiation de l’epithelium epididymaire. Il n’existe aucune information sur la regulation transcriptionnelle des Cxs dans l’epididyme durant la differenciation. L’objectif principal de ce projet etait d’identifier les mecanismes impliques dans la regulation de l’expression des Cxs lors de la differentiation de l’epididyme. Afin d’elucider de tels mecanismes, le promoteur de Gjb2 a ete caracterise. Les resultats ont montre que Gjb2 possede un site unique d’initiation de la transcription au sein de l’epididyme. L’analyse de la sequence du promoteur de Gjb2 a revele la presence de sites de liaison possibles des facteurs de transcription SP1 (Specificity Protein 1) et TFAP2A (Transcription Factor Activating Protein 2 Alpha). Nous avons montre que la region basale du promoteur se situe dans les 230 pb en amont du site d’initiation de la transcription identifie. Des experiences de mutation dirigees et de retard sur gel ont confirme la liaison de SP1 et TFAP2A au promoteur de Gjb2 ainsi que leurs implications dans l’activation de cette Cx. Des experiences d’immunoprecipitation de la chromatine (ChIP) ont permis de montrer que la liaison de ces facteurs de transcription diminue avec l’âge, ce qui correle avec la diminution de l’expression de Gjb2. Ces resultats confirment le role activateur de SP1 et TFAP2A dans l’expression de Gjb2 chez les jeunes individus. Nous nous sommes ensuite interesses aux mecanismes impliques dans la diminution de Gjb2 lors de la differenciation. La methylation du promoteur de Gjb2 et le facteur KLF4 (Kruppel-like factor 4) ne sont pas impliques dans la diminution de la liaison de SP1 et TFAP2. Le role des hormones dans la regulation des Cxs a egalement ete evalue. A l’aide de tissus de rats castres et de rats castres avec implant de testosterone, nous avons montre que Gjb2 et Gjb1 sont regules par les androgenes. La castration augmente les niveaux de proteines de GJB2 et diminue ceux de la GJB1 au sein de l’epididyme. De plus, les androgenes regulent egalement les niveaux proteiques de GJB4 dans l’epididyme. Nous avons egalement evalue le role des glucocorticoides (hydrocortisone et dexamethasone) et de l’oestradiol sur l’expression de Gjb2. Nous avons montre que les glucocorticoides augmentent les niveaux d’ARNm de Gjb2 alors que l’oestradiol n’a pas d’effet. Le promoteur de Gjb1 a egalement ete etudie dans les cellules epididymaires et dans le tissu. Nos resultats montrent que Gjb1 est transcrit par le promoteur P1 dans l’epididyme alors qu’il est transcrit par le promoteur P2 dans les cellules RCE-1. Nous avons clone 5kb du promoteur de Gjb1 dans un plasmide rapporteur de luciferase afin d’etudier son activite transcriptionnelle. Nous avons identifie des elements de reponse aux glucocorticoides, aux oestrogenes et aux androgenes sur le promoteur de Gjb1. Nos resultats suggerent que les androgenes jouent un role dans l’expression de Gjb1. Dans l’ensemble, ces travaux permettent une meilleure comprehension des mecanismes de regulation de l’expression des Cxs dans l’epididyme. De plus, les donnees generees dans cette etude permettront de mieux comprendre les mecanismes responsables des changements d’expression des Cxs dans d’autres tissus ainsi que dans certaines pathologies impliquant ces deux Cxs. Abstract The epididymis is the organ responsible for sperm maturation and plays an essential role in the acquisition of male fertility. This critical process is dependent on interaction of spermatozoa with the luminal microenvironment of the epididymis. The composition of this specific microenvironment is regulated by the epithelial cells of the epididymis and changes throughout the organ. This suggests a complex coordination of epithelial cells. Cellular communication is crucial for cell coordination and is orchestrated by gap junctions. These junctions form transmembrane channels between adjacent cells, which enable them to communicate by direct exchange of ions and small molecules. Connexins (Cxs) are proteins that form these transmembrane channels. In the adult rat epididymis, Gjb5 (Cx30.3), Gjb4 (Cx31.1), Gjb1 (Cx32) and Gja1 (Cx43) are present while Gjb2 is only detectable in young animals when the epithelium is undifferentiated. Change in the expression of Cxs is associated with changes in gap junctional permeability that allow cells to modify their exchanges. During epididymal epithelial differentiation, there is a change in the expression of Cxs, suggesting a key role of Cxs the regulation of the differentiation of the epididymal epithelium. There is no information on the transcriptional regulation of the Cxs in the epididymis. The main objective of this project was to identify the mechanisms involved in the regulation of the expression of Cxs during epididymal differentiation. To elucidate these mechanisms, the promoter of Gjb2 was first characterized. The results showed a single transcriptional start site for Gjb2 in the epididymis. The analysis of the sequence of the Gjb2 promoter revealed the presence of potential binding sites for transcription factors SP1 (Specificity Protein 1) and TFAP2A (Transcription Factor Activating Protein 2 Alpha). We have shown that the basal promoter region is located within the 230 bp upstream of the identified initiation start site. Directed mutagenesis and EMSA experiments confirmed the binding of TFAP2A and SP1 on the Gjb2 promoter and their role in the activation of this Cx. ChIP experiments showed that the binding of these transcription factors decreases with age, which correlates with the decreased expression of Gjb2. These results confirm the activating role TFAP2A and SP1 in the transcriptional activation of Gjb2 in young animals. We then looked at the mechanisms involved in the decrease of Gjb2 during differentiation. It appears that the methylation of the promoter of Gjb2 and KLF4 factor (Kruppel-like factor 4) are not involved in the decreased binding of SP1 and TFAP2 with age. Finally, the role of hormones in the regulation of Gjb2 and Gjb1 was investigated in the epididymis. Using tissue from orchidectomized rats and orchidectomized rats with testosterone implants, we showed that Gjb2 and Gjb1 are regulated by androgens in the epididymis and ventral prostate. Orchidectomy increases the protein levels of Gjb2 and decreases those of Gjb1. Moreover, Gjb4 levels were decreased with orchidectomy. We also evaluated the role of glucocorticoids (hydrocortisone and dexamethasone) on the expression of Gjb2 and we have shown that glucocorticoids increase the mRNA levels of Gjb2. Estradiol did not have an effect on Gjb2 expression. The promoter of Gjb1 was also characterized in epididymal cells as in the tissue. Our results show that Gjb1 is not transcribed from the same promoter in the cells and in the tissue. In the tissue, Gjb1 is transcribed from P1 whereas in the cells it is transcribed from P2. DNA sequence analysis showed androgen, estrogen and glucocorticoid response elements on the promoter of Gjb1. Our results suggest that androgens are involved in the regulation of Gjb1 gene expression. Overall, this work provides a better understanding of the mechanisms regulating the expression of Cxs in the epididymis during the differentiation of the epithelium. Furthermore, the data generated in this study will help to better understand the mechanisms regulating the expression of Cxs in other tissues as well as in certain diseases that involve both Cxs.