鸭IFN-β mRNA SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的  建立一种检测鸭IFN-β mRNA转录水平的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法。 方法  根据GenBank中鸭IFN-β（KT428159）核苷酸序列设计并合成特异性引物，将鸭IFN-β基因克隆至pET-30a载体，以此构建的pET-30a-IFN-β阳性重组质粒作为阳性标准品，采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测，构建标准曲线，并进行引物特异性、灵敏度及重复性试验。 结果  该扩增特异性强，无引物二聚体及非特异性产物，熔解曲线单峰（Tm=87.94±0.16℃）；Ct值在8.9～34.0线性拟合程度高，相关系数R2＞99.5%；灵敏度高，最低检测为2.84 copies·μL−1；重复性好，对来自临床的3种组织样品检测的组内变异系数小于0.13%，组间变异系数不超过1%。 结论  该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为鸭IFN-β mRNA表达水平的定量分析提供了技术手段。