小鼠VCAM-1表达载体的构建及稳定高表达间充质干细胞系C3H10T 1/2的建立

本研究旨在构建小鼠血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）的逆转录病毒载体,通过转染建立稳定高表达VCAM-1的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,并初步探讨VCAM-1基因过表达对MSC免疫学特性的影响.以小鼠脾脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入PMSCVmigr-1逆转录病毒载体,构建重组逆转录病毒表达质粒PMSCVmigr-1-mVCAM-1,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术转染293细胞,收获含有病毒颗粒的上清;用病毒上清感染间充质干细胞系（C3H10T 1/2）并检测其表达.采用3H-TdR掺入法测定高表达VCAM-1的MSC在淋巴母细胞转化实验中对淋巴细胞增殖的抑制作用.结果表明：酶切和测序鉴定证实,正确构建了小鼠VCAM-1的重组逆转录病毒表达质粒.逆转录病毒上清感染MSC后流式细胞术检测到目的基因VCAM-1在MSC表面高表达.高表达VCAM-1的MSC对刀豆素A诱导的淋巴细胞增殖具有显著抑制作用,且呈剂量效应关系.结论：成功构建了小鼠VCAM-1基因的重组逆转录病毒质粒并使其在MSC中稳定高表达.高表达VCAM-1的MSC对体外淋巴细胞增殖具有很强的抑制效果.本课题为进一步研究VCAM-1基因调控MSC干预免疫相关性疾病奠定了实验基础.