Untersuchungen zur Enantioselektivität von Lipasen auf molekularer Ebene durch computergestütztes Molecular Modeling und molekularbiologische Methoden

Die Enantioselektivitat von mikrobiellen Lipasen bei der Hydrolyse und Veresterung von primaren Alkoholen konnte in dieser Arbeit erstmals in ihren molekularen Zusammenhangen verstanden werden. Demnach beruht die Enantioselektivitat auf sterischen Wechselwirkungen nur weniger Reste der Lipase mit hauptsachlich dem grosen Substituenten des Substrats. Die Lipase von Pseudomonas cepacia (PCL) ist die einzige mikrobielle Lipase, die ein breites Spektrum an primaren Alkoholen enantioselektiv umsetzt. Daher wurde diese zur Etablierung eines Computermodells, dem in silico Assay, verwendet. Molecular modeling Untersuchungen der entsprechenden PCL-Substrat-Komplexe wurden anhand von Substraten durchgefuhrt, deren Daten uber die Enantioselektivitat aus der Literatur entnommen wurden, um den in silico Assay zur Vorhersage der Enantiopraferenz von PCL gegenuber primaren Alkoholen zu etablieren. Diese Untersuchungen zeigten, dass das bevorzugte Enantiomer tiefer als das nicht bevorzugte oder ausschlieslich in einem bestimmten Strukturmotiv in der Bindungstasche, dem His gap, bindet. Diese Bewegung der Substrate in das His gap wird durch einen Torsionswinkel beschrieben. Da das bevorzugte Enantiomer sich in allen untersuchten Fallen tiefer in das His gap bewegt, ist der resultierende Torsionswinkel fur dieses Enantiomer auch immer groser als fur das nicht bevorzugte. Dadurch wird zum ersten Mal die Vorhersage der Enantiopraferenz fur primare Alkohole moglich. Zur Uberprufung dieses Modells wurden molecular modeling Untersuchungen fur funf weitere Substrate (Substrat A: 1,2-Propanediol; Substrat B: 1,2-Dodecanediol; Substrat C: 1-Phenyl-1,2-ethanediol; Substrat D: 2-Phenyl-1-propanol; Substrat E: Dihydro-5-(hydroxymethyl)-2(3H)-furanone) unternommen, fur die bislang keine experimentellen Daten uber die Enantioselektivitat der PCL bekannt waren. Anhand des vorliegenden Modells konnte aufgrund der unterschiedlichen Bewegung der beiden Enantiomere der Substrate A-E ins His gap eine Vorhersage der Enantiopraferenz getroffen werden. Anschliesend wurde Substrat E mit rekombinanter PCL umgesetzt, die Substrate und Produkte mit Hilfe der Gaschromatographie bestimmt und der resultierende E-Wert berechnet. Die richtige Vorhersage der Enantiopraferenz wurde fur das Substrat E bestatigt. Da das Modell (in silico Assay) die Vorhersage der Enantiopraferenz der PCL-katalysierter Umsetzung primarer Alkohole erlaubt, erfolgte im nachsten Schritt die Ausweitung des Modells zum Verstandnis und zur gezielten Vorhersage der Enantioselektivitat PCL gegenuber dieser Substratklasse. Es konnte beobachtet werden, dass je tiefer sich das bevorzugte und je weniger tief sich das nicht bevorzugte Enantiomer in das His gap bewegten, desto groser war nicht nur die resultierende Differenz der Torsionswinkel des bevorzugten und des nicht bevorzugten Enantiomers, sondern auch der experimentell ermittelte E-Wert. Daher wurden in silico Mutanten der PCL gesucht, die eine deutliche Anderung der Differenz der Torsionswinkel Folge haben sollten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Modell zur Vorhersage und Beschreibung der Enantioselektivitat von Candida rugosa Lipase (CRL) gegenuber chiralen Carbonsauren etabliert. Die Enantioselektivitat der CRL bei der Veresterung dieser Substratklasse konnte somit ebenfalls erstmals vorhergesagt werden. Die Bindungstasche der CRL besteht aus einem hydrophobic dent, in dem der Alkoholrest bindet und einem hydrophobic tunnel, in dem die Saure bindet. Molecular modeling Untersuchungen zeigten, dass die Enantiopraferenz der CRL gegenuber Carbonsauren anhand eines Torsionswinkels vorhergesagt werden kann. Dieser Torsionswinkel beschreibt die Bewegung des grosen Substituenten am Stereozentrum in den hydrophobic tunnel und die des mittleren Substituenten in eine bestimmte Bindungstaschenregion, das acid his gap, das durch die Seitenketten der Aminosauren F345 und H449 gebildet wird. Der grose Substituent der beiden Enantiomere eines Substrates band beinahe identisch. Der mittlere Substituent des nicht bevorzugten Enantiomers eines chiralen Carbonsauresubstrates bewegte sich jedoch tief in das acid his gap. Aus diesem Grund war der Torsionswinkel des bevorzugten Enantiomers ( 300°). Die Bewegung des mittleren Substituenten des nicht bevorzugten Enantiomers in das acid his gap druckte die Seitenkette des katalytischen H449 weg. Die Enantioselektivitat korrelierte mit dem Abstand zwischen katalytischem Histidin zum Sauerstoff der mit dem Substrat veresterten Alkoholgruppe des nicht bevorzugten Enantiomers dHNe-OAlk. Enantioselectivity of lipases towards primary alcohols In this work a model has been established to predict enantiopreference of Pseudomonas cepacia lipase-catalysed hydrolysis and acylation of chiral primary alcohols which was validated with literature data on enantiopreference of 50 substrates. The enzyme-substrate complexes were relaxed by performing molecular dynamics simulations, and the resulting average structures of the substrates were geometrically analysed. In the model, the large substituent of the preferred enantiomer always moves deeper into a well defined binding pocket, the His gap, formed by the side chain of catalytic H286 and its neighbour L287. Enantiopreference can be predicted by measuring a single torsion angle which describes this movement. Enantioselectivity of lipases towards carboxylic acids This work describes a computer model to predict enantiopreference and enantioselectivity of lipases from Candida rugosa (CRL) and Pseudomonas cepacia (PCL) for lipase-catalyzed esterification of carboxylic acids. The tetrahedral substrate intermediates were docked to the enzymes, the complexes relaxed by molecular dynamics simulations, and averaged structures were geometrically analyzed. The medium-sized substituent of the non-preferred enantiomer moved deep into the acid His gap, a binding pocket formed by the catalytic histidine and its structural neighbor towards the binding site for the acid moiety (CRL: H449 and F345; PCL: H286 and V267), while the non-preferred enantiomer did not move into the acid His gap. This motion is reflected by a torsion angle fCtert.-C* around the bond between the tetrahedral carbon (Ctert) and the α-carbon at the chiral center (C*), which for all substrates was smaller in the case of the preferred enantiomer (preferred enantiomer: fCtert.-C* 300°). As a consequence, the medium-sized substituent pushed the side chain of the catalytic histidine apart. For CRL, the experimentally determined E-value correlated with the distance dHNe-OAlc between catalytic histidine and the oxygen of the alcohol moiety. There are two regions: low E-values (E 80) for dHNe-OAlc. >2.1 A