Papel de TLR4 del neutrófilo en el ictus agudo experimental

El sistema inmune es capaz de provocar una respuesta contra un estimulo de tipo no patogeno, lo que se denomina inflamacion esteril. Las moleculas endogenas que se liberan cuando un tejido se dana pueden iniciar una respuesta inflamatoria mediante la activacion de receptores como el TLR4 (del ingles, Toll-like receptor 4). Este receptor se expresa en los neutrofilos, ademas de en otras celulas circulantes. Los neutrofilos constituyen la primera linea de defensa del sistema inmune innato ya que son las primeras celulas en responder cuando se produce un proceso de inflamacion aguda. La respuesta inmune subsecuente a un ictus isquemico es un factor crucial en la fisiopatologia y la resolucion del ictus. Se conoce que TLR4 esta implicado en el dano cerebral y la inflamacion despues del ictus y que la ausencia de TLR4 induce la reprogramacion neutrofilica hacia un fenotipo alternativo en isquemia cerebral, lo que concuerda con un papel diferencial de los neutrofilos en ausencia de TLR4. Con estos antecedentes, en la presente Tesis Doctoral, propusimos como hipotesis que el TLR4 neutrofilico es el responsable del dano inducido en el tejido cerebral despues del ictus. Ademas, nos planteamos si la ausencia de TLR4 podria inducir la polarizacion del neutrofilo hacia el fenotipo N2, asociado con la neuroproteccion. Finalmente, nos planteamos si la falta de TLR4 podria modificar las funciones del neutrofilo y, como consecuencia, alterar su contribucion al proceso inflamatorio. Para el analisis transcriptomico se utilizaron ratones de fenotipo salvaje asi como ratones TLR4KO. Para evaluar el papel del TLR4 neutrofilico en la neuroproteccion tras ictus utilizamos ratones que no expresan TLR4 en las celulas mieloides (TLR4loxP/Lyz-cre) asi como sus respectivos controles (TLR4loxP/loxP) en los que el volumen de infarto se determino mediante imagen por resonancia magnetica. El analisis estereologico se utilizo para determinar la infiltracion de los neutrofilos y el fenotipo de los mismos. Ademas, se utilizo una combinacion de citometria de flujo, microscopia confocal y microscopia intravital para evaluar las diferentes funciones neutrofilicas en ambos genotipos. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral demuestran, mediante el analisis transcriptomico de los neutrofilos con y sin TLR4, que el TLR4 neutrofilico modula la contribucion de los neutrofilos a la inflamacion inducida por la isquemia, la migracion al parenquima y su funcionalidad. Tambien, que la deficiencia especifica de TLR4 en las celulas mieloides esta involucrada en la neuroproteccion despues del ictus ya que el volumen de infarto de los ratones cuyos neutrofilos no expresan TLR4 es significativamente menor lo que es concomitante con un aumento en la infiltracion de neutrofilos sin TLR4 en el tejido isquemico. Ademas, la ausencia de TLR4 reprograma los neutrofilos hacia un fenotipo N2. En homeostasis, la ausencia de TLR4 mantiene a los neutrofilos en un estado de ?juventud? que se desregula, al menos en parte, tras un estimulo isquemico. Ademas, impide que los neutrofilos sigan su fluctuacion circadiana normal. En relacion a las funciones de los neutrofilos, aquellos que no expresan TLR4 muestran una actividad fagocitica mayor en el estado basal, son preferencialmente engullidos por la microglia tras el ictus, producen menos especies radicales de oxigeno en las primeras etapas del proceso inflamatorio y son mas susceptibles de producir NETs in vitro pero no in vivo. Finalmente, en modelos inflamatorios fuera del SNC (sistema nervioso central) los neutrofilos que no expresan TLR4 se adhieren a los vasos e infiltran con menor eficiencia en el tejido. En conclusion, los resultados indican que TLR4 representa un papel fundamental en la polarizacion del neutrofilo, ya que su ausencia reprograma a los neutrofilos hacia un fenotipo N2 y modula la induccion de diferentes rutas asociadas con el proceso inflamatorio, asi como altera distintas funciones neutrofilicas.