Regulación de la expresión de versicano y su relación con la diferenciación de las células de melanoma humano

La composicion de la matriz extracelular (MEC) determina algunos aspectos cruciales del comportamiento tumoral. Entre sus componentes destacan glicoproteinas y proteoglicanos (PGs), algunos de los cuales tienen receptores en la membrana celular. Nuestro grupo de investigacion esta interesado en la biologia de los PGs en el melanoma humano. El VS es un PG de matriz de la familia de los hialectanos. Esta formado por tres dominios: G1, G2 y G3. El splicing alternativo del dominio central G2 genera cuatro isoformas denominadas V0, V1, V2 y V3. En celulas de melanoma humano se ha descrito la expresion de proteoglicanos como el proteoglicano especifico de melanoma (mel-PG), CD44 o versicano (VS), cuya presencia fue descrita en nuestro laboratorio. Asimismo, describimos su capacidad para incrementar la proliferacion y migracion en celulas de melanoma humano, ademas de disminuir su adhesion. En la primera parte de este trabajo determinamos el patron de expresion de las isoformas de VS y de mel-PG durante el proceso de desdiferenciacion de las celulas de melanoma, utilizando lineas celulares con diferentes grados de diferenciacion (temprano, intermedio y tardio). Nuestros resultados muestran que el grado de diferenciacion de las celulas determina la expresion diferencial de VS y mel-PG, de tal forma que las lineas celulares mas indiferenciadas expresan todas las isoformas de versicano y las mas diferenciadas ninguna de ellas. De ello concluimos que la perdida del estado diferenciado se acompana de la expresion de las diferentes isoformas de VS, hecho que parece ser comun en tumores derivados de celulas con mismo origen embrionario, como muestran nuestros analisis preliminares realizados en celulas de neuroblastoma y astrocitoma. Durante el proceso de diferenciacion in vitro de las lineas celulares SK-mel-1.36-1-5 y SK¬mel-3.44 estos PGs desaparecen, por lo que proponemos que la produccion de versicano es senal de regresion a un estado no diferenciado durante la progresion tumoral, y que existe un patron temporal para la expresion de cada isoforma de versicano. En la segunda parte analizamos la regulacion del promotor de VS en lineas celulares de melanoma humano con grados de diferenciacion temprano y tardio. Aislamos, secuenciamos y clonamos el promotor de VS humano. El analisis in silico del mismo determino tres regiones de regulacion: la primera en el extremo 5', presenta dos cajas de reconocimiento para TCF-4; la segunda en la zona central, 6 cajas de union para Sp1, 7 para AP¬2 y una para Smad3/4; y la tercera en el extremo 3', una caja de union para AP-1. Construimos diversos mutantes de delecion disenados para aislar el papel de cada uno de los elementos reguladores del promotor de VS y los transfectamos de manera transiente en las lineas celulares. Los resultados muestran que TCF-4 es un activador responsable de mas del 50% de la actividad total de este promotor, ya que la sobrexpresion de algunos de los participantes de la via de senalizacion de TCF-4 tiene un efecto directo sobre la actividad del mismo. Ademas, mediante ensayos de EMSA determinamos la union especifica del complejo TCF-4/?-catenina. En la region central reside aproximadamente el 10% de la actividad total del promotor y hemos determinado la union especifica a 3 de los posibles sitios de union para Sp1. Planteamos por tanto, que Sp1 es un modulador o quizas regulador de respuesta rapida de VS. Por ultimo, en la region 3' del promotor, que contiene la secuencia de reconocimiento para AP-1, se encuentra el 40% restante de la actividad y hemos determinado que dicha secuencia es la responsable de la actividad basal de VS.