Untersuchung zur Replikationsstrategie des humanpathogenen Sapovirus

Humanpathogene Sapoviren gehoren zur Familie der Caliciviridae und verursachen vor allem bei Klein¬kindern und Senioren Gastroenteritiden. Die Replikationsstrategie von humanpathogenen Sapoviren ist bislang ungeklart, da weder ein geeignetes Tiermodell noch ein etabliertes Zellkulturmodell zur Verfugung stehen. Aus diesem Grund sollte die Replikation in einem Saugerzellsystem etabliert werden. Die Ergebnisse der Untersuchungen sollen zu einem besseren Verstandnis der Replikationsstrategie der humanpathogenen Sapoviren beitragen und konnen die Grundlage fur weitere Unter¬suchungen der Replikationsstrategie der Caliciviren bilden sowie zur Entwicklung geeigneter antiviraler Masnahmen und Medikamente beitragen. Fur die Untersuchung der Replikationsstrategie des humanpathogenen Sapovirus wurde ein Sapovirus-Volle-Lange-Klon aus Patientenmaterial (Stuhlgang-Probe) generiert. Nach der molekularen Charakterisierung konnte der Stamm Hu/SaV/Dresden/pJG-SapI/2004/DE (GenBank-Zugangsnummer AY694184) der Genogruppe I Genotyp 1 der Sapo¬viren zugeordnet werden. Fur die Untersuchung der Translation des humanpathogenen Sapovirus in Saugerzellen wurden polyklonale Antikorper in Kaninchen gegen die nichtstrukturellen und strukturellen Sapovirus-Proteine generiert. Im zellfreien System konnte die Sensitivitat und Spezifitat dieser Antikorper validiert werden. Auserdem wurde die Translation im zellfreien System mit bereits bestehenden Ergebnissen verglichen. Die Prozessierung des ORF1-Polyproteins erfolgte in die nichtstrukturellen Proteine NS1, NS2, NS3NTPase, NS4, NS5VPg, die Fusionsproteine NS1-3, NS2-3, NS4-5, NS4-7, NS5-7 und NS6 7Pro-Pol sowie das strukturelle Protein VP1. Fur die Charakterisierung der Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Saugerzellen wurden verschiedene Sapovirus-Volle-Lange-cDNA-Klone generiert. Fur das Sapovirus-Volle-Lange-RNA-Genom pJG-SapI-T7 konnte eine Translation der Sapovirus-Proteine nach¬gewiesen werden. Die Transfektion von 293T-Zellen erfolgte mit in vitro transkribierter RNA, die ein Cap-Analogon und einen Poly(A)-Schwanz besas. Durch die dem Sapovirus-Genom vorangestellte Kozak-Sequenz, welche als Ribosomenbindungsstelle dient, konnte auch nach Mutation des aktiven Zentrums des nichtstrukturellen Proteins NS7Pol (RNA-abhangige RNA-Polymerase) eine Translation des Sapovirus-ORF1-Polyproteins nachgewiesen werden. Somit erwies sich dieses Konstrukt als ungeeignet fur die Untersuchung der Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Saugerzellen. Nach Klonierung des Sapovirus-Volle-Lange-cDNA-Genoms in den pACYC-MCSII-Vektor (pJG-SapI-T7) konnte nach in vitro Transkription ein gekapptes Sapovirus-Volle-Lange-RNA-Genom mit einem Poly(A)-Schwanz generiert werden, welches vermutlich die richtigen 5’- und 3’-Sapovirus-Enden enthalt. Nach Transfektion von 293T-Zellen konnten die nichtstrukturellen Fusionsproteine NS2-3, NS4-5, NS4-7 und NS6-7Pro-Pol sowie das strukturelle Protein VP1 im Western Blot nachgewiesen werden. Nach Mutation des aktiven Zentrums des nichtstrukturellen Proteins NS6Pro…