Estudio de fagos codificantes de toxina Shiga subtipo 2a presentes en aislamientos nativos de Escherichia coli

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un microorganismo que coloniza el tracto intestinal de los animales y causa en el hombre diarreas y graves enfermedades, entre ellas, el sindrome uremico hemolitico (SUH). El SUH es una afeccion severa que afecta con mayor frecuencia a ninos menores de 5 anos. En ninos y adolescentes representa una de las principales causas de insuficiencia renal aguda y cronica, y es el responsable de una importante proporcion de los trasplantes de rinon. Es una enfermedad para la cual no existe tratamiento especifico y, en los casos mas graves, puede derivar en la muerte del paciente. Argentina presenta la mayor incidencia de SUH a nivel mundial. El ganado bovino es reconocido como el principal reservorio de STEC, y el consumo de alimentos derivados contaminados, como la principal via de transmision a humanos. El contacto directo con animales portadores, y su entorno, y el contacto persona a persona son otras fuentes importantes de contagio. Varios factores de virulencia han sido descriptos para estas bacterias, pero no se conocen cuales son las caracteristicas que definen con certeza a una cepa STEC con capacidad de producir enfermedad grave. El mecanismo de patogenicidad comun a todas y que juega un papel esencial en el desarrollo de SUH, es la produccion de toxina Shiga (Stx). Diversos subtipos de Stx han sido descriptos y asociados a distintos riesgos de desarrollar enfermedades. El subtipo Stx2a es el mayormente asociado a SUH. Dentro del genoma bacteriano, los genes stx se encuentran codificados en bacteriofagos temperados, denominados fagos Stx. Estos fagos, que muestran una gran diversidad, desempenan un rol fundamental en la patogenesis de STEC: influyen en la expresion de stx, y durante la lisis bacteriana, producto de la induccion de los profagos, se produce la liberacion de estas toxinas. Estos fagos tambien desarrollan un importante papel en la propagacion y transferencia de genes de virulencia y, como consecuencia, en la formacion de cepas patogenas emergentes. Se han identificado mas de 400 serotipos de STEC y alrededor de 100 han sido asociados a enfermedad en humanos. En la mayoria de las infecciones el serotipo involucrado es O157:H7. Sin embargo, en la actualidad existen a nivel mundial muchos casos de enfermedad causados por cepas de otros serotipos. El objetivo general de esta tesis fue caracterizar los fagos codificantes de stx2a presentes en cepas STEC de distintos serotipos aisladas en Argentina. Para ello se propuso resubtipificar las cepas, caracterizar regiones involucradas en la regulacion del ciclo litico de los fagos, cuantificar los niveles de expresion y de induccion de profagos Stx2a y comparar los resultados obtenidos de acuerdo a distintas particularidades de los fagos y de las cepas portadoras. Tambien se evaluo el comportamiento de un mismo fago en diferentes entornos bacterianos. En cuanto a la resubtipificacion, todas las cepas previamente caracterizadas como portadoras del subtipo vt2EDL933 fueron positivas para stx2a. Las cepas que ademas portaban el/los subtipo/s vt2vha y/o vt2vhb se resubtipificaron como positivas para stx2c y las cepas que presentaban el subtipo vt1EDL933, fueron positivas para stx1a. En la mayoria de las cepas se confirmo la proximidad del gen ninG a stx2 y la presencia del alelo q933, solo o en combinacion con el alelo q21. De las cepas negativas para ninG, una fue positiva para el alelo qO111 y el resto negativas para los 3 alelos de q estudiados. En general, las cepas que presentaron el alelo q933 portaban el subtipo stx2a y las positivas para los alelos q933 y q21, portaban stx2a y stx2c. Si bien esta asociacion entre subtipos de stx y alelos de q ya ha sido observada en otros trabajos, no es una asociacion exclusiva. En cuanto al alelo qO111, se encontro en una cepa genotipo stx1a/stx2a. Los niveles de expresion de stx2a detectados entre las cepas fueron heterogeneos, tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, y se encontraban dentro de los ordenes de magnitud reportados por otros grupos de trabajo. Solo en una de las cepas O145:H- de origen humano no se detecto expresion en ninguna de las condiciones. En la mayoria de las cepas tratadas con mitomicina C la expresion de stx2a fue mayor respecto a la expresion basal, con la excepcion de una cepa O91:H21 y la O113:H21, ambas aisladas de alimentos, que mostraron una expresion similar en ambas condiciones. Mediante el metodo de la capa doble de agar se detecto produccion de particulas infectivas de fagos en la mayoria de las cepas analizadas. Los titulos de fagos con mitomicina C aumentaron en un rango de entre 1 y 3 ordenes de magnitud con respecto a los titulos fagos inducidos de manera espontanea Algunos fagos produjeron placas de lisis turbias, dificiles de ver y poco definidas. En una cepa O26:H11 y en dos O157:H7, se evidenciaron por hibridacion placas de lisis no detectadas visualmente. Por qPCR, los niveles de induccion de fagos Stx2a fueron variables y se encontraban dentro de los ordenes de magnitud reportados por otros investigadores. El aumento en la produccion de fagos Stx2a con mitomicina C tambien se evidencio en la mayoria de las cepas, en un rango de 1 a 2,5 logs. Las excepciones fueron una cepa O91:H21 de bovino, que produjo similares cantidades fagos en ambos estados, y dos cepas que no produjeron particulas detectables de fagos Stx2a: otra cepa O91:H21 y la O145:H- que tampoco presento expresion de stx2a. En cuanto a la comparacion de los resultados teniendo en cuenta diferentes variables, se observaron: a) mayor expresion basal de stx2a en las cepas O157:H7 que en las O26:H11, pero en respuesta a mitomicina C, mayor incremento en las cepas O26:H11 que en las O145:H- y O157:H7; b) mayor incremento de la expresion de stx2a con mitomicina C en las cepas aisladas de bovino que en las aisladas de humanos; c) niveles basales de expresion de stx2a inferiores en las cepas positivas para q933 que en las positivas para q933 y q21, y en las cepas ninG negativas con respecto a las ninG positivas; d) un mayor aumento en la produccion de fagos con mitomicina C en las cepas que portaban solo el subtipo stx2a con respecto a las que portaban tanto stx2a como stx2c. Por otra parte, se observo una correlacion positiva moderada entre los niveles de expresion basales e inducidos. Dado que en la bibliografia no se ha observado una unica tendencia en la asociacion entre los niveles de expresion de stx2a y de produccion de fagos con las distintas caracteristicas de las cepas, los resultados obtenidos son, en algunos casos, similares a los reportados por otros investigadores. Tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, en los lisogenos generados se detecto expresion de stx2a, placas de lisis y produccion de Stx. Comparado con los resultados obtenidos en cada ensayo con la cepa wild type correspondiente, los niveles de expresion estuvieron dentro del mismo orden, la produccion de fagos de los lisogenos fue mayor y la cantidad de Stx presente en sus sobrenadantes fue igual o ligeramente menor. En resumen, se encontro que la mayoria de las cepas, independientemente del serotipo y el origen, portaron fagos Stx2a inducibles, mostraron expresion basal de stx2a y aumento en la expresion e induccion de profagos por efecto del agregado de mitomicina C. Ademas, los lisogenos obtenidos se comportaron de manera similar a las cepas wild type. Estos resultados sugieren que los fagos estudiados aportan caracteristicas asociadas a una alta virulencia a las cepas que los portan, las cuales, en consecuencia y sin importar su serotipo, representan un potencial riesgo para la salud humana. Las caracteristicas observadas de los fagos Stx2a presentes en las cepas circulantes en nuestra region, aisladas tanto de bovinos como de humanos, podrian contribuir a la alta incidencia de enfermedad observada.