Aislamiento de organelos en macrófagos humanos infectados con Mycobacterium tuberculosis

Antecedentes: Desde hace mas de 40 anos, tanto la centrifugacion diferencial como la centrifugacion por gradiente de densidad son utilizadas para el aislamiento de organelos subcelulares. Sin embargo, en estas tecnicas no siempre se conservan las propiedades biologicas de los organelos, por lo tanto, es necesario realizar modificaciones tecnicas que permitan aislar organelos conservando sus propiedades biologicas. Metodologia: Se obtuvieron monocitos derivados a macrofagos a partir de 180 mL de sangre periferica de voluntarios sanos. Los macrofagos se infectaron con Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), homogenizaron mecanicamente y ultracentrifugaron utilizando un gradiente de Percoll al 27%. Posteriormente, el homogenizado se fracciono manualmente de acuerdo con su densidad en 30 fracciones. Resultados: Los organelos fueron separados de acuerdo con su densidad. La membrana plasmatica con una densidad de 1.040 g/mL se localizo en las fracciones 10-14. Los fagosomas y fagolisosomas con una densidad de 1.109 g/mL se localizaron en las fracciones 22-29. La caracterizacion de los organelos subcelulares fue realizada mediante metodos fluorometricos especificos por la identificacion de acoplamiento de biotina (membrana plasmatica), identificacion de fracciones conteniendo M. tuberculosis y de la enzima fagolisosomal b-hexosaminidasa. Conclusiones: La tecnica de ultracentrifugacion en combinacion con tecnicas enzimaticas es util para aislar y caracterizar fagosomas, fagolisosomas y membrana plasmatica. Estos organelos estan involucrados en el procesamiento y presentacion de antigenos, su aislamiento es crucial para el estudio de su papel en la respuesta inmune