Survival of vitrifi ed mouse blastocysts loaded into glass micro-capillaries

espanolEl objetivo de este estudio fue determinar las tazas de expansion y eclosion in vitro de los blastocistos murinos vitrificados en micro-capilares de vidrio (BrandR - 5 �EL). En el dia 4 de prenez, los blastocistos eran colectados de las donantes, evaluados morfologicamente y localizados en tres diferentes grupos: Grupo 1 (Control): compuesto por los embriones que eran transferidos a gotas de 100 �EL de medio KSOM y cultivados in vitro por un periodo de 72 h; Grupos 2 y 3: compuesto por los embriones que eran expuestos inicialmente a la solucion de equilibrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min, y posteriormente a la solucion de vitrificacion (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por un periodo de 30 seg. Posteriormente, los blastocistos, eran almacenados dentro de micro-pipetas de vidrio (GMP) o micro-capilares de vidrio (GMC) y sumergidos en nitrogeno liquido (-200 ��C). La dilucion de los crioprotectores y desvitrificacion de los embriones fue realizada al colocarlos en gotas de 500 �EL de PBSm suplementado con 0.25 M de sacarosa a una temperatura de 37 ��C. Despues de 5 minutos los embriones fueron transferidos a gotas de 100 �EL de medio KSOM y cultivados in vitro por 72 h. Las tazas de expansion de los blastocistos, posteriores al cultivo fueron de 77% (138/177) y 74% (131/175), para los blastocistos vitrificados en GMP y GMC, respectivamente. Las tazas de eclosion fueron de 91% (134/146) para el grupo control, siendo mayores que para los embriones vitrificados en GMP 61% (108/177) y GMC 53% (93/175). El numero del indice de masa celular interna (ICM) para los embriones del grupo control fue de 25.7 �} 2.5 celulas, no teniendo diferencia significativa con el numero de celulas observado en los embriones vitrificados en GMP (24.2�}2.3) o GMC (22.5�}2.59). Ademas, las celulas del trofoectodermo, en el grupo control presentaron 63.1�}3.0 celulas, no siendo tampoco diferentes de las celulas de los embriones vitrificados en GMP (58.0�}1.8) o GMC (58.0�}.3.7). En conclusion, las GMC comerciales (BrandR) probadas en este estudio muestran la misma eficiencia que las GMP para la vitrificacion de embriones murinos. portuguesO objectivo de este estudo foi determinar as taxas de expansao e eclosao in vitro dos blastocitos murinos vitrificados em micro capilares de vidro (BrandR - 5 �EL). No quarto dia de prenhes, os blastocitos foram colectados das doadoras, avaliados morfologicamente e localizados em tres diferentes grupos: Grupo 1 (Controle): composto por os embrioes que foram transferidos a gotas de 100 �EL de KSOM e cultivados in vitro por um periodo de 72 h; Grupos 2 e 3: composto por os embrioes que foram expostos inicialmente a solucao de equilibrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH e 0.5% PVA) por 1 min, e posteriormente a solucao de vitrificacao (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por um periodo de 30 seg. Posteriormente, os blastocistos, foram armazenados dentro de micro pipetas de vidro (GMP) ou micro capilares de vidro (GMC) e submergidos em nitrogenio liquido super-resfriado (-200��C). A diluicao dos crioprotetores e desvitrificacao dos embrioes foi realizada ao colocar-lhos em gotas de 500 �EL de PBSm suplementado com 0.25 M de sacarose a uma temperatura de 37 ��C. Depois de 5 minutos, os embrioes foram transferidos a gotas de 100 �EL de KSOM e cultivados in vitro por 72 h. As taxas de expansao dos blastocistos, posteriores ao cultivo foram de 77% (138/177) e 74% (131/175), para os blastocistos vitrificados em GMP e GMC, respectivamente. As taxas de eclosao foram de 91% (134/146) para o grupo controle, e foram maiores os embrioes vitrificados em GMP 61% (108/177) e GMC 53% (93/175). O numero do indice de massa celular interna (ICM) para os embrioes do grupo controle foi de 25.7 �} 2.5 celulas, nao havendo diferencia significativa com o numero de celulas observado em embrioes vitrificados em GMP (24.2�}2.3) ou GMC (22.5�}2.59). Alem do mais, as celulas do trofoectodermo, no grupo controle apresentaram 63.1�}3.0 celulas, no sendo diferente as celulas dos embrioes vitrificados em GMP (58.0�}1.8) ou GMC (58.0�}.3.7). Em conclusao, as GMC comerciais (BrandR) provadas neste estudo indicam a mesma eficiencia que as GMP para a vitrificacao de embrioes murinos. EnglishThe purpose of this study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouse blastocysts loaded into glass micro-capillaries (Brand® - 5 iL). Early morning on day 4 of pregnancy, blastocysts were collected from donors, morphologically evaluated, and then allocated in three groups: Group 1 (Control): embryos were transferred into 100 iL of KSOM medium drops and in vitro cultured during 72 h; Groups 2 and 3: embryos initially exposed to the equilibration solution (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) for 1 min, and then to vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. After that, blastocysts were loaded into glass micropipettes (GMP) or glass microcapillaries (GMC) and plunged into super-cooled liquid nitrogen (-200 °C). Embryo warming and cryoprotectant dilution were carried out into 500 iL droplets of PBSm supplemented with 0.25 M sucrose maintained at 37 °C. After 5 min embryos were transferred to 100 mL droplets of KSOM medium and cultured in vitro for 72 h. Blastocyst expansion rates after in vitro culture were 77% (138/177) and 74% (131/175), for blastocysts vitrified in GMP and GMC, respectively. Blastocyst hatching rate (control group) was 91% (134/146), which was higher than for embryos loaded in GMP 61% (108/177) and GMC 53% (93/175). ICM number in control group embryos contained 25.7 ± 2.5 cells and did not differ from the mean cell number observed in vitrified embryos loaded in GMP (24.2±2.3) or GMC (22.5±2.59). Regarding the trophoectoderm cell number, Group 1 embryos displayed 63.1±3.0 cells, and also not differ from the cell numbers of the embryos loaded into GMP (58.0±1.8) or GMC (58.0±.3.7). In conclusion, manufactured GMC (Brand®) tested in this study showed same efficiency as GMP for vitrification of mouse blastocysts.