pcDNA3．1-VEGF165质粒转染骨髓基质干细胞后血管内皮生长因子的表达

目的：检测pcDNA3．1-VEGF165载体转染对兔骨髓基质干细胞血管内皮生长因子表达的影响。方法：实验于2005-0712006-01在山东省青岛市市立医院中心试验室完成。OpcDNA3．1-VEGF165质粒由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科杨述华教授惠赠。②选取1月龄新西兰大白兔1只，无菌条件下取胫骨和股骨，进行骨髓基质干细胞的分离与培养。（墨）转染前24h计数细胞，每孔5×10^5细胞接种于6孔板，待骨髓基质干细胞达到80％～90％融合时准备转染，设立未转染组、空载体组和载体组。未转染组无特殊处理，空载体组转染pcDNA3．1载体，载体组转染pcDNA3．1-VEGF165。④转染后72h，反转录聚合酶链反应检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165mRNA的表达：酶联免疫吸附法检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165蛋白的含量。结果：①骨髓基质细胞分离培养形态观察：初始分离的骨髓细胞呈圆形，大小不一；24h后有少量细胞贴壁；48h后贴壁细胞部分为成纤维样细胞；72h贴壁的成纤维样细胞数不断增加；96h后贴壁生长的细胞主要为梭形的成纤维样细胞；分瓶后细胞形成克隆；传代后细胞贴壁生长，分裂相增多，并不断增殖分化形成均一的梭形细胞。②转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165mRNA的表达情况：反转录聚合酶链反应检测到载体组在576bp处有明显条带，空载体组和未转染组均未见血管内皮生长因子165表达。③转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165蛋白含量检测结果：酶联免疫吸附结果显示，载体组转染pcDNA3．1-VEGF165载体的骨髓基质细胞培养上清液中血管内皮生长因子165蛋白浓度为（170．1±14．3）ng／L，而空载体组与未转染组均未检测到血管内皮生长因子165蛋白表达，差异有显著性意义（t均=42．206，P=0．000）。结论：应用pcDNA3．1-VEG