Exocytose : analyse de la cinétique du développement du pore de fusion et de la libération sécrétoire associée

L'exocytose, la derniere etape du processus de secretion, a ete etudiee sur des cellules neuroendocrines modeles (PC12). Nous avons caracterise l'internalisation d'un analogue synthetique de neurotransmetteur (FFN102) dans les vesicules des cellules PC12. La difference de potentiel d'oxydation de la dopamine et de ce faux neurotransmetteur fluorescent a ete exploitee pour montrer que l'internalisation de FFN102 s'effectue en remplacant 10% de la dopamine endogene presente dans les vesicules. De plus, la cinetique de liberation de FFN102 suggere son stockage dans un compartiment de la vesicule ou sa diffusion est facilitee. Cette sonde electroactive et fluorescente associee aux cellules PC12 constitue donc un systeme de choix pour des etudes bioanalytiques impliquant la liberation de neurotransmetteurs par exocytose. L'exocytose debute par la formation d'un pore forme par la fusion de la membrane vesiculaire avec la membrane de la cellule. Les mecanismes de regulation de l'expansion du pore de fusion ne sont pas completement connus. Nous avons montre que la myosin II limite la vitesse d'expansion du pore en detectant la liberation de la dopamine par amperometrie et en traitant les cellules PC12 avec un inhibiteur pharmacologique. La mesure de la cinetique d'ouverture du pore a l'aide d'un modele developpe recemment a montre que la myosin II ne modifie pas la taille maximale du pore au cours de la liberation de neurotransmetteurs. Ce suivi amperometrique de l'expansion du pore est limite a une duree de quelques dizaines de millisecondes. Afin d'etendre la duree du suivi de l'expansion du pore, nous avons realise des mesures simultanees de liberation de la dopamine par amperometrie et d'evolution de la membrane vesiculaire par TIRFM. La membrane des vesicules a ete marquee par des proteines fluorescentes sensibles au pH et genetiquement encodees. Nous avons pu ainsi observer l'evolution du pore qui s'acheve par une fermeture ou une expansion complete. La quantite de neurotransmetteurs detectee etait plus importante dans le cas d'une expansion totale du pore.