Etude d'un arn catalytique : le ribozyme du virus de l'hepatite delta

Le virus de l'hepatite delta est un virus a arn tout a fait unique dans le monde animal. En revanche, il partage un grand nombre de similitudes avec les viroides et les petits arns satellites des virus infectant les vegetaux. Parmi celles-ci, son mode de replication utilisant probablement un mecanisme en cercle roulant et la presence d'une activite ribozymique au sein des formes genomiques et antigenomiques de l'arn viral. Toutefois, le ribozyme de l'hepatite delta se distingue des motifs en tete de marteau et en epingle a cheveux rencontres jusqu'a present chez les pathogenes des plantes. Dans l'espoir de developper un ribozyme capable de catalyser des coupures intermoleculaires (reactions en trans), nous nous sommes d'abord attaches a mieux comprendre l'activite autocatalytique du ribozyme de l'hepatite delta en allant a la recherche des elements structuraux et des sequences necessaires a son fonctionnement. Pour ce faire, nous avons introduit des mutations au sein de deux regions du plus petit fragment d'arn genomique ayant conserve une activite optimale. En analysant a diverses temperatures les cinetiques d'autocoupure de ces mutants, nous avons ete en mesure de faire la distinction entre les changements qui affectent directement le site catalytique du ribozyme et ceux qui provoquent une instabilite accrue de la molecule ou la formation de structures alternatives inactives. Ainsi, nous avons decouvert qu'en aval du site de coupure, les nucleotides +45 a +72, qui peuvent former une longue epingle a cheveux tres stable, ne participent pas directement a la catalyse de la reaction mais sont impliques dans la formation et la stabilite de la structure active. Nous avons montre egalement que les nucleotides +17 a +19 et +28 a +30 forment une petite helice watson-crick indispensable a l'activite du ribozyme mais que la sequence de cette mini helice a peu d'influence sur son efficacite. En revanche, la sequence des nucleotides +21 a +26, qui constituent une boucle dans la structure secondaire, est determinante pour l'activite. Dans une deuxieme partie, nous avons reussi a convertir la reaction de coupure intramoleculaire en une reaction intermoleculaire par laquelle un fragment d'arn de 74 nucleotides (le ribozyme) est capable de cliver en trans un fragment substrat de 14 nucleotides. Cependant, cette reaction n'est pas efficace puisque le taux de clivage en trans s'avere toujours inferieur a une molecule de substrat par molecule de ribozyme. Enfin, dans une troisieme partie, nous nous sommes interesses a l'inhibition de l'activite d'autocoupure du ribozyme delta par divers oligonucleotides antisens adn et arn