高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素 b 5 还原酶I的克隆、表达和功能鉴定

目的鉴定产油微生物高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素 b 5 还原酶Ⅰ的功能。 方法将高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素 b 5 还原酶Ⅰ基因与人可溶性细胞色素 b 5 还原酶基因序列比对，去除该基因N端穿膜区域后，与人可溶性细胞色素 b 5 基因分别在大肠杆菌中异源表达；通过钴离子亲和层析、离子交换和分子排阻色谱等方法对表达产物进行纯化；以 2,6-二氯靛酚钠(DCIP)为底物，测定细胞色素 b 5 还原酶Ⅰ的体外活性及其对NADH和NADPH的偏好性；在反应体系中存在NADH时，通过全波长扫描方法检测细胞色素 b 5 还原酶Ⅰ与细胞色素 b 5 的相互作用。 结果高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素 b 5 还原酶Ⅰ被成功可溶表达，经纯化后检测到体外活性：使用NADH时酶活为564.57 U，使用NADPH时为51.97 U；在NADH存在时，细胞色素 b 5 还原酶Ⅰ能够还原细胞色素 b 5 ，其吸收峰从411 nm偏移至422 nm，并在521 nm和554 nm处吸光值增加。 结论细胞色素 b 5 还原酶Ⅰ N端穿膜区域的去除增加了其可溶性，并保持了蛋白质活性；高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素 b 5 还原酶Ⅰ基因编码的是一种NADH-细胞色素 b 5 还原酶，其在体外能与细胞色素 b 5 相互作用。